Острые миелобластные лейкозы

Содержание

В основе развития многообразных форм острых миелобластных лейкозов (ОМЛ) лежит злокачественная трансформация миелоидных клеток-предшественников. Пролиферацией клеток с цитоморфологическими признаками миелобластов, монобластов, эритробластов и мегакариобластов обусловлены лейкемическая инфильтрация костного мозга и выход бластных клеток в периферическую кровь. Различные типы ОМЛ превалируют в общей структуре ост­рых лейкозов у взрослого населения (более 80%) и составляют 15–20% острых лейкозов у детей [1–5].

Данные лабораторных исследований периферической крови и костного мозга при ОМЛ могут варьировать. У 70% больных развитие ОМЛ сопровождается лейкоцитозом, а у 10–20% — может наблюдаться лейкопения [6, 7]. У большинства больных начальными признаками заболевания являются анемия, тромбоцитопения и нейтропения, что обусловлено замещением костного мозга лейкемическими клетками или действием выделяемых ими факторов.

В большинстве случаев костный мозг у больных ОМЛ гиперклеточный и лишь у немногих пациентов, преимущественно пожилого возраста, отмечается гипо­плазия, напоминающая апластическую анемию.

Наиболее общие цитологические признаки патологических клеток при различных формах ОМЛ следующие: размер относительно мономорфных бластов колеблется от среднего до крупного; структура ядерного хроматина нежная; в ядрах четко выявляются от 2 до 4 ядрышек; в цитоплазме бластов могут обнаруживаться нежные гранулы; в 60–70% случаев в цитоплазме отмечается наличие палочек Ауэра; в созревающих миелоидных клетках нередко обнаруживаются признаки дисплазии.

Диагностика отдельных форм ОМЛ, как правило, основывается на анализе цитоморфологических и цитохимических признаков бластных клеток костного мозга и периферической крови. К базисным методам относятся окраска липидов СЧВ, цитохимическое определение активности миелопероксидазы (МПО), хлорацетатэстеразы (ХАЭ), НЭ, КФ, наличия PAS-положительных веществ. С их помощью диагноз ОМЛ устанавливают в подавляющем большинстве случаев.

Получившая широкое распространение во многих странах мира ФАБ-классификация острых лейкозов [8] неоднократно дополнялась и уточнялась [9–12] в отношении вариантов и подвариантов ОМЛ. Создатели ФАБ-классификации предложили для установления природы лейкемических бластов определение активности МПО, НЭ, окраску СЧВ. Совсем недавно Международный совет по стандартизации в гематологии [13] рекомендовал применять с этой целью реакции на МПО и комбинированную окраску на ХАЭ и НЭ для идентификации бластов с признаками гранулоцитарной и моноцитарной дифференцировки соответственно.

В настоящее время ФАБ-классификация фактически дополнена данными иммунологических и цитогенетических исследований, которые позволяют сделать более точные выводы о природе клеток злокачественно трансформированного клона.

Проведение иммунофенотипирования обязательно, если в бластных клетках пациента цитохимически не определяется активность МПО или же количество пероксидазоположительных бластов невелико, а именно при ОМЛ М0, М5, М6 и М7. В части случаев иммунофенотипирование помогает при дифференциации ОМЛ М1 и М2, ОМЛ М2 и М4, при диа­гностике ОМЛ М3v. Отдельные подтипы ОМЛ, выделенные на основании наличия в бластных клетках специфических генетических аномалий, характеризуются строго очерченным иммунологическим фенотипом. Наличие некоторых антигенных детерминант имеет важное прогностическое значение. Определение экспрессии антигенов на бластных клетках до начала специфической терапии позволяет оценить наличие клона патологических клеток в процессе проводимой терапии, при детекции минимальной резидуальной болезни (МРБ).

Цитогенетические методы (традиционная цитогенетика, метод цепной полимеразной реакции — ЦПР, гибридизации in situ — FISH-метод) позволяют определить прогностически важные транслокации, а также точно диагностировать некоторые подтипы ОМЛ с наличием в бластных клетках специфических аберраций.
Важное значение для установления диагноза острого лейкоза и ОМЛ в частности имеет определение содержания бластных клеток в костном мозге [1, 2, 14]. Считается, что диагноз ОМЛ правомочен, когда бластные клетки составляют 30% и более среди неэритроидных клеточных элементов костного мозга [1, 2, 14]. В опубликованной недавно новой классификации ВОЗ опухолевых заболеваний кроветворной и лимфоидной ткани этот порог снижен до 20% [5]. Таким образом, к числу ОМЛ должна быть отнесена рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации (РАИБТ­), ранее считавшаяся одной из основных форм миелодиспластических синдромов (МДС).

По мнению создателей ФАБ-классификации, при ОМЛ следует выделять три типа основных субстратных клеток — миелобластов. Миелобласты I типа имеют высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, нежную структуру неконденсированного ядерного хроматина, содержат 2–4 четко определяемых ядрышка. Окраска цитоплазмы, не содержащей азурофильных гранул, колеблется от бледной до умеренно базофильной. Миелобласты II типа — это клетки, по цитоморфологическим признакам сходные с бластами I типа, с более низким ядерно-цитоплазматическим соотношением, содержащие в цитоплазме до 20 нежно окрашивающихся азурофильных гранул. Близкие к этим клеткам по структуре промиелоциты имеют более крупные размеры, чем миелобласты I и II типа, и содержат многочисленные азурофильные гранулы.

В редких случаях у больных ОМЛ в костном мозге и периферической крови обнаруживаются миелобласты с многочисленными азурофильными гранулами, которые некоторые авторы считают бластами III типа [11, 15]. Миелобласты III могут быть преобладающими в ряде случаев при ОМЛ М2 (ОМЛ с признаками созревания), ассоциированном с транслокацией t (8; 21) [15].

В соответствии с ФАБ-классификацией в ее современном виде выделяют восемь основных форм заболевания (ОМЛ М0–М7). В их число входят острый миелобластный лейкоз с минимальными признаками дифференцировки (ОМЛ М0); острый миелобластный лейкоз без признаков созревания (ОМЛ М1); острый миело­бластный лейкоз с признаками созревания (ОМЛ М2); острый промиелоцитарный лейкоз (ОМЛ М3) и вариант острого промиелоцитарного лейкоза (ОМЛ М3v), острый миеломоноцитарный лейкоз (ОМЛ М4), острый монобластный и моноцитарный лейкоз (ОМЛ М5а и ОМЛ М5b); острый эритролейкоз (ОМЛ М6); острый мегакариобластный лейкоз (ОМЛ М7).

Помимо определяющего значения процентного содержания бластных клеток различного происхождения при выделении основных форм и вариантов ОМЛ учитывается количество (%) незрелых и зрелых клеток гранулоцитарного и моноцитарного ряда среди неэритроидных костномозговых (НКМ) клеток, количество клеток эритробластического ряда среди всех ядро­содержащих клеток костного мозга (ЯКМ) (табл. 15).

Незыблемым остается правило — для установления диагноза ОМЛ необходимо наличие не менее 30% бластов в костном мозге (по новым критериям ВОЗ — более 20%). Но если при ОМЛ М0, ОМЛ М1 и ОМЛ М2 это должны быть исключительно миелобласты I и II типа, то при ОМЛ М3 преобладающей популяцией субстратных клеток являются аномальные промиелоциты (содержание миелобластов ниже 30%). При ОМЛ М5а пролиферирующие клетки имеют вид монобластов, также отличающихся по структурным и энзимохимическим признакам от миелобластов. При ОМЛ М5b преобладающим типом клеток являются промоноциты, занимающие промежуточное место между монобластами и моноцитами. При ОМЛ М7 определяющиеся в костном мозге и периферической крови варьирующие по форме и размерам лейкемические клетки имеют свои отличительные гистогенетические особенности.
Помимо основных форм ОМЛ, выделяемых в соответствии с ФАБ-классификацией, встречаются и другие более редкие формы заболевания, такие как острый базофильный лейкоз, острый панмиелоз с миелофиброзом и др. [5].

ОМЛ М0 (острый миелоидный лейкоз с минимальными признаками дифференцировки)

Редкая форма ОМЛ встречается у 2–5% детей и взрослых. Не имеет специфических клинических признаков. Сообщается, что ОМЛ М0 более рефрактерный к химиотерапии, чем другие формы ОМЛ [16, 17]. У большинства больных наблюдаются анемия и тромбоцитопения. Количество лейкоцитов в перифериче­ской крови может быть резко увеличенным или сниженным. В пунктатах костного мозга отмечается гипер­клеточность, обусловленная инфильтрацией бластными клетками (лишь у немногих больных пожилого возраста костный мозг может быть гипоклеточным). Содержание бластных клеток (преимущественно миелобласты I типа) в костном мозге нередко достигает 90–95%. Бластные клетки напоминают лимфобласты (L2, иногда L1), не содержат зернистости, палочек Ауэра, цитохимически инертны. Возможно присутствие МПО и ХАЭ менее чем в 3% бластов, что также встречается и при ОЛЛ, слабое диффузное окрашивание цитоплазмы при определении PAS-положительных веществ. В бластных клетках не определяется активность НЭ, не наблюдается окрашивание СЧВ.

Диагноз устанавливают только на основе ультраструктурных исследований и/или иммуноцитохимического определения МПО и экспрессии по крайней мере одного из панмиелоидных антигенов (CD33, CD13, CD117). В последнее время антиген CD117 расценивают как более специфичный маркер миелоидной направленности дифференцировки бластов, чем антигены CD13 и CD33, поскольку его экспрессия найдена в 67% случаев ОМЛ и только в 4% ОЛЛ при анализе 1937 случаев заболевания у взрослых и детей [17]. Чаще всего бласты также коэкспрессируют антигены CD34, HLA-DR, CD38, CD7, TdT, что характерно для полипотентных клеток-предшественников гранулоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов и моноцитов/макрофагов. Другие антигены миелоидных и лимфоидных клеток обычно не выявляются.

Цитогенетические аномалии (чаще — моносомия 7, трисомия 13, трисомия 4, трисомия 8, комплексные аномалии) и реарранжировка генов IgH и/или Т-клеточного рецептора определяются у большинства больных, однако специфические аберрации не описаны.

Дифференциальную диагностику проводят прежде всего с ОЛЛ (отсутствие основных лимфоидных антигенов — CD3, CD79a, CD22; экспрессия CD13, CD33, MПO), ОМЛ М7 (отсутствие активности КФ, НЭ в зоне аппарата Гольджи, в большинстве случаев отрицательная PAS-реакция; отсутствие экспрессии мегакариоцитарных маркеров — CD61, CD41a, CD42, CD62; наличие активности МПО).
Вариант прогностически неблагоприятен. При рецидиве бластные клетки могут соответствовать по фенотипическим признакам монобластам и мегакариобластам, что подтверждает их происхождение из «потомков» полипотентных стволовых кроветворных клеток.

ОМЛ М1 (острый миелоидный лейкоз без признаков созревания)

ОМЛ М1 составляет 10–20% ОМЛ [6, 18]. Заболевание чаще встречается у взрослых, чем у детей. Признаки гепатоспленомегалии и лимфаденопатии наблюдаются у 30% больных. Почти у 50% пациентов отмечается лейкоцитоз (у 30% показатели превышают 100•109/л), у 25% — лейкопения, панцитопения. Практически у всех больных выявляется анемия и у 75% — тромбоцитопения, нередко менее 50•109/л [1].

В мазках из пунктата костного мозга отмечается практически полное замещение нормальных кроветворных клеток бластами. Изредка костный мозг может быть гипоклеточным, наблюдаются признаки миелофиброза.

Бласты, инфильтрирующие костный мозг и обнаруживающиеся в периферической крови, относятся преимущественно к миелобластам I типа. Это клетки среднего или крупного размера с варьирующим ядерно-цитоплазматическим соотношением. Ядра бластных клеток округлые или овальные, содержат одно или несколько относительно четко выявляемых ядрышек. Цитоплазма бластов содержит немногочисленные азурофильные гранулы, может быть вакуолизированной. Палочки Ауэра обнаруживаются в варьирующем числе бластов почти у половины больных с ОМЛ М1. Палочки Ауэра определяются в миелобластах даже в тех случаях, когда менее 3% из них являются МПО- и СЧВ-положительными. В созревающих клетках гранулоцитарного ряда, когда они имеются в мазках крови и костного мозга, могут обнаруживаться признаки дисплазии.

Бластные клетки при ОМЛ М1 дают положительную реакцию при выявлении МПО, ХАЭ и окраске СЧВ [3, 4]. В миелобластах обнаруживается слабая реакция при определении активности -НЭ и отрицательная при выявлении КНЭ. Реакция на КФ обычно слабая. При PAS-реакции в цитоплазме миелобластов наблюдается слабое диффузное окрашивание. Палочки Ауэра, определяемые в цитоплазме части миелобластов, дают положительную реакцию на МПО и окрашиваются СЧВ. При PAS-реакции наблюдается их слабое окрашивание, реакция на ХАЭ обычно отрицательная [19].
Типичный фенотип бластов при ОМЛ М1 — CD33+ CD13+ CD64+ CD15+ CD117+ CD38+ HLA-DR+ МПО+. Возможна экспрессия на части бластов антигенов CD34, CD7, TdT, CD16, CD11с, CD11в. От ОМЛ М0 отличается появлением (в дополнение к CD33 и CD13) антигенов, характерных для бипотентных клеток-предшественников гранулоцитов/макрофагов и последующих стадий дифференцировки — CD64, CD15 (хотя последний может определяться и на более ранних стадиях), и снижением экспрессии маркеров стволовой гемопоэтической клетки (в частности, CD34).

Однако в целом строго очерченного иммунофенотипического профиля бластных клеток при ОМЛ М1, как и при большинстве других форм заболевания, нет.

Специфические цитогенетические аномалии, ассоциированные с ОМЛ М1, не описаны. Однако транслокация t (9; 22) (q34; q11), при которой образуется химерный транскрипт генов BCR/ABL, характерная для ХМЛ и ОЛЛ у взрослых (около 25%), среди ОМЛ чаще встречается при ОМЛ М1 (реже — при ОМЛ М2, М4, М0). При этом на бластных клетках чаще обнаруживается экспрессия CD7, TdT, В клеточных антигенов [20]. Прогноз неблагоприятный, даже при проведении интенсивной терапии.

Дифференциальный диагноз проводят с ОЛЛ L2. ОМЛ М1 отличается тем, что более 3% бластных клеток дают положительную реакцию при выявлении актив­ности МПО и при окраске СЧВ. При преобладании миелобластов I типа и незначительном количестве пер­оксидазопозитивных бластов основным является выявление экспрессии на бластах миелоидных антигенов и МПО с помощью мкАТ. При преобладании миело­бластов II типа ОМЛ М1 дифференцируют с ОМЛ М2 (учитывается клеточный состав пунктата костного мозга, более «зрелый» фенотип бластов при ОМЛ М2).
Дифференциация ОМЛ М1 и ОМЛ М5а основывается на результатах цитохимического выявления активности МПО, НЭ и КНЭ. Миелобласты обнаруживают умеренную и выраженную реакцию на МПО, слабую при определении активности НЭ и отрицательную при выявлении КНЭ. Монобласты при ОМЛ М5а могут быть МПО-отрицательными или проявлять слабую реакцию при определении активности фермента, выраженную положительную реакцию на НЭ и КНЭ.

Мегакариобласты при ОМЛ М7, в отличие от бластов при ОМЛ М1, являются МПО- и СЧВ-отрицательными. Бласты при остром базофильном лейкозе содержат азурофильные гранулы, которые могут быть МПО-положительными или отрицательными. Основным методом, позволяющим различить эти две формы заболевания, является ультраструктурное исследование.

ОМЛ М2 (острый миелоидный лейкоз с признаками созревания)

ОМЛ М2 составляет около 30% всех случаев ОМЛ [1, 2, 6, 18]. Заболевание встречается как у взрослых, так и детей. Среди больных 20% составляют лица моложе 25 лет и 40% — люди пожилого возраста (старше 60 лет). Из общих симптомов выделяются геморрагические проявления. У 25% больных обнаруживаются признаки лимфаденопатии и у 15% — гепатоспленомегалии [6]. Практически во всех случаях омечается анемия и тромбоцитопения. У 50% больных наблюдается выраженный лейкоцитоз, а у 25% — лейкопения [6].

Критериями для диагностики ОМЛ М2 в соответствии с ФАБ-классификацией является наличие не менее 30% бластов в костном мозге и периферической крови. Как правило, содержание бластов составляет 30–89% от общего количества неэритроидных клеток костного мозга. Характерно для этой формы ОМЛ также наличие более 10% клеток гранулоцитарного ряда с признаками созревания (промиелоцитов, миелоцитов) и нейтрофилов, нередко с выраженными диспластическими признаками — гипердольчатость или гиподольчатость ядер, псевдопельгеровские лейкоциты, гипо- или гипергрануляция цитоплазмы, отсутствие МПО и липидов [1, 2]. Могут наблюдаться также признаки дисэритропоэза (эритробласты с многодольчатыми ядрами, асинхронностью созревания ядра и цитоплазмы, признаками кариорексиса). Количество клеток моноцитарного ряда (монобластов, промоноцитов и моноцитов) не превышает 20% от общего числа неэритроидных клеток костного мозга.

Цитоморфологические признаки субстратных клеток — миелобластов варьируют довольно широко: от среднего размера (диаметром 10–12 m) с относительно узким ободком агранулярной цитоплазмы до крупных клеток с обширной цитоплазмой, содержащей азурофильные гранулы. Преобладающими бластами у большинства больных, в отличие от ОМЛ М1, являются миелобласты II типа [1, 2]. Палочки Ауэра в цитоплазме бластов обнаруживаются у 60–70% больных. В большинстве случаев клетки содержат 1–2 палочки Ауэра. Палочки Ауэра могут определяться и в более зрелых клетках гранулоцитарного ряда [1].

Изредка у больных ОМЛ М2 в костном мозге и периферической крови преобладают миелобласты III типа. Количество миелобластов I и II типа не превышает 10%. Бласты III типа содержат многочисленные азурофильные гранулы.

Цитохимический профиль бластных клеток при ОМЛ М2 такой же, как и при ОМЛ М1. Но при этом значительно больший процент клеток выявляет положительную реакцию при определении активности МПО и при окраске СЧВ. Выше и интенсивность окрашивания цитоплазмы клеток. В большинстве бластов определяется также активность ХАЭ. Реакция при выявлении активности КФ и НЭ слабая диффузная, в последнем случае не ингибируется 0,03 М фторидом натрия. Активность КНЭ в миелобластах и незрелых клетках гранулоцитарного ряда при ОМЛ М2 не определяется.
Антигенный профиль бластных клеток при ОМЛ М2 в целом соответствует миелобластам (экспрессия CD13, CD33, CD15, CD64, CD16, MПO и чаще отсутствие или небольшое число клеток с экспрессией антигенов стволовой клетки и маркеров коммитации — CD34, CD117, TdT, CD38, HLA-DR, лимфоидных и моноцитарных антигенов — CD2, CD7, CD4, CD14). В отдельных случаях иммунофенотипирование помогает в дифференциации ОМЛ М1 и М2 (более частая экспрессия при ОМЛ М2 антигена CD16 при частом отсутствии антигенов стволовой клетки и маркеров коммитации); ОМЛ М2 и М4 (экспрессия при ОМЛ М4 антигенов CD7, CD4, CD14, CD64) [1, 2, 21, 22].

Среди цитогенетических аномалий с ОМЛ М2 ассоциирована транслокация t (8; 21) (q22; q22), которая, однако, также отмечена в части случаев при ОМЛ М1 и М4.
ОМЛ М2, ассоциированный с транслокацией t (8; 21), в новой классификации ВОЗ выделен как отдельный подвариант. Он встречается примерно в 40% случаев ОМЛ М2 у детей и 20% у взрослых (9% ОМЛ в целом, 14% у детей и 6% у взрослых), причем среди заболевших взрослых больше мужчин молодого возраста. Бластные клетки при этом подварианте имеют ряд характерных особенностей (миело­бласты III типа). Они гетерогенны по размеру, ядро обычно с выемкой и крупным ядрышком, цитоплазма базофильна, иногда только по периферии клетки, может быть вакуолизирована, содержит палочки Ауэра. Последние обнаруживаются и в созревающих гранулоцитарных элементах, включая сегментоядерные нейтрофилы. У 90% больных с транслокацией t (8; 21) зрелые нейтрофильные лейкоциты имеют гомогенную розовую цитоплазму по сравнению с 2% у больных с ОМЛ М2 без данной транслокации [23].

Цитохимические свойства бластных клеток не имеют особенностей по сравнению с группой ОМЛ М2 в целом. Антигенный спектр соответствует бластам при ОМЛ М2, за исключением экспрессии антигена CD19, что с высокой степенью вероятности коррелирует с наличием транслокации t (8; 21). Чаще, чем при ОМЛ М2 в целом, экспрессируются TdT, CD34, CD56, реже — антиген CD13 [17]. Следует также отметить, что экспрессия антигена CD19 встречается и при других вариантах ОМЛ, в частности при ОМЛ М4 и М5, при которых она не ассоциирована с какими-то генетическими реарранжировками [24].

Подтип прогностически благоприятен. Частота до­стижения полной ремиссии выше, особенно при использовании высоких доз цитозинарабинозида при проведении консолидирующей терапии. Однако у больных с экспрессией антигена CD56 продолжительность ремиссий короче, чем при его отсутствии [25]. Дифференциальный диагноз чаще проводят с МДС. В этой связи следует отметить, что описан вариант МДС (рефрактерная анемия с избытком бластов) с транслокацией t (8; 21), который авторы расценивают как редкое клиническое начало ОМЛ М2 с сохраненной способно­стью лейкозогенных клеток-предшественников к дифференцировке в зрелые нейтрофильные лейкоциты, в которых также выявлена подобная транслокация [26].

Для выделения подварианта основное значение имеет обнаружение транслокации t (8; 21). При этом предпочтение отдается ЦПР, которая позволяет выявить транскрипт химерного гена при отсутствии видимой цитогенетической аномалии, а также при транслокациях с вовлечением хромосомы 3. С применением ЦПР частота данного подтипа среди ОМЛ возросла. Выявление экс­прессии антигена CD19 на бластах с морфоцитохимическими признаками, соответствующими ОМЛ М2, в большинстве случаев также позволяет правильно идентифицировать данный подтип заболевания.

У больных с подтипом ОМЛ М2, ассоциированным с транслокацией t (8; 21), с помощью количественной ЦПР и, реже, двухцветной цитофлуориметрии проводят мониторинг состояния клона злокачественно трансформированных клеток, который позволяет выделить группу больных с высоким риском развития рецидива и идентифицировать пациентов, нуждающихся в проведении дополнительных терапевтических вмешательств или трансплантации костного мозга [27].

В большинстве случаев ОМЛ М2 бластные клетки имеют дифференцировочные признаки клеток нейтрофильного ряда. У некоторых больных отмечаются признаки созревания клеток эозинофильного и базофильного ряда.

ОМЛ М2Эо. Подтип ОМЛ М2 с наличием более 5% эозинофилов среди неэритроидных костномозговых элементов (до 7% всех случаев ОМЛ). Может сочетаться с транслокацией t (8; 21), но не обязательно. Аномалии хромосомы 16 не выявляются. В этом случае степень эозинофилии ассоциирована с прогнозом заболевания, у больных с более высоким содержанием эозинофилов отмечается благоприятное течение болезни. Цитохимических и иммунофенотипических особенностей бластные клетки при данном варианте не имеют. В эозинофилах, в отличие от М4Эо, отсутствует активность ХАЭ. Дифференциация проводится с М4Эо, острым эозинофильным лейкозом, гиперэозинофильным синдромом.

ОМЛ М2Baso. Подтип ОМЛ М2 с наличием более 5% базофилов среди неэритроидных костномозговых элементов (около 1% случаев ОМЛ). Ассоциирован с транслокацией t (6; 9) (p23; q34). Кроме ОМЛ М2Baso транслокация встречается при ОМЛ М4Baso, а также при МДС, сопровождающемся повышенным содержанием базофилов в костном мозге. Другая цитогенетическая аномалия, ассоциированная с ОМЛ М2, М4 с базофилией, — делеция или транслокация короткого плеча хромосомы 12 (р11–13). М2Baso, как и М4Baso, — прогностически неблагоприятный вариант ОМЛ, бластные клетки не имеют специфических цитохимических и иммунофенотипических свойств (час­то CD34- и TdT-негативны), в анамнезе заболевания острому лейкозу часто предшествует МДС, при исследовании пунктата костного мозга определяются признаки дисплазии в гранулоцитарном, эритроидном и мегакариоцитарном ростках кроветворения [28].

ОМЛ М2Baso следует отличать от редкой формы заболевания — базофильного острого лейкоза, при котором бластные клетки имеют ультраструктурные признаки базофильной дифференцировки без наличия или при наличии минимальной дифференцировки по другим линиям. Они содержат различное количество базофильных гранул, обладают метахромазией. МПО, НЭ при цитохимическом исследовании обычно не определяются, PAS-реакция имеет характер блоков, КФ — диффузного окрашивания цитоплазмы. Иммунофенотип неспецифичен: CD13+ CD33+ CD117+ HLA DR+ CD34+ CD38+ TdT+ CD9+. Клинически заболевание не имеет никаких отличий от ОМЛ М2. Аномалии хромосомы 12 и транслокация t (6; 9) отсутствуют, однако у части больных в бластных клетках выявляется транслокация t (9; 22) (q34; q11).

Дифференциальную диагностику ОМЛ М2 проводят с ОМЛ М1, М4, М6. Ранее, до создания ВОЗ классификации опухолевых заболеваний кроветворной и лимфоидной ткани, часто возникала необходимость в дифференциации ОМЛ М2 и РАИБ-Т [5]. Сложной проблемой в диагностическом плане остаются редкие случаи ОМЛ М2, когда преобладающей клеточной популяцией являются миелобласты III типа. Их необходимо дифференцировать с острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ М3), с «блоком созревания» на стадии промиелоцита, наблюдающемся при агранулоцитозе, обусловленном применением лекарственных препаратов и лейкемоидными реакциями. В пользу ОМЛ М3 свидетельствуют обнаружение клеток с многочисленными палочками Ауэра, лабораторные данные, указывающие на наличие ДВС-синдрома, выявление специфических цитогенетических аномалий — t (15; 17) [1].

Ряд клинико-лабораторных данных может быть использован для отличия «гипергранулярного» варианта ОМЛ М2 от лейкемоидных реакций и агранулоцитоза, при которых не снижается уровень гемоглобина, не уменьшается количество тромбоцитов, в костном мозге сохраняются мегакариоциты и клетки эритробластического ряда.

ОМЛ М3 (острый промиелоцитарный лейкоз)

Составляет 5–10% случаев ОМЛ. Встречается во всех возрастных группах, но очень редко у детей в возрасте до 10 лет. Средний возраст больных — 38–40 лет [1, 6]; соотношение мужчин и женщин составляет 2:1.

Основные симптомы, связанные с геморрагическими проявлениями, наблюдаются у 90% больных. Гепатоспленомегалия и лимфаденопатия отмечается не более чем у 20% пациентов.
У 80–90% больных с ОМЛ М3 при поступлении в стационар отмечаются выраженная анемия и тромбоцитопения, признаки ДВС-синдрома. Почти у половины больных количество тромбоцитов не превышает 50•109/л. Количество лейкоцитов в периферической крови больных варьирует — от лейкопении до выраженного лейкоцитоза. У пациентов с гипергранулярным ОМЛ М3 лейкопения наблюдается чаще. Среднее количество лейкоцитов в крови часто не превышает 1,5–2•109/л.

ОМЛ М3 характеризуется пролиферацией аномальных промиелоцитов. Согласно ФАБ-классификации выделяют два цитоморфоцитологических варианта заболевания. Превалирующий гипергранулярный вариант ОМЛ М3 характеризуется преобладанием в костном мозге атипичных промиелоцитов, содержащих в цитоплазме большое количество азурофильных гранул и палочки Ауэра. При этом нередко присутствуют клетки, имеющие 10–20 и более палочек Ауэра, сливающихся друг с другом. Такие клетки получили название «faggot cells» (клетки, содержащие «пучок прутьев»). Ядра клеток разнообразны по форме и величине. Они могут быть почкообразными, складчатыми, напоминающими по структуре ядра незрелых моноцитоидных клеток. Содержание миелобластов в костном мозге обычно не превышает 8–10%.

Больные с гипогранулярным вариантом — ОМЛ М3v — имеют типичную для ОМЛ М3 клиническую симптоматику (наличие выраженного геморрагического синдрома). ОМЛ М3v встречается примерно в 4 раза реже, чем основной вариант ОМЛ М3. Промиелоциты при ОМЛ М3v имеют меньшее количество азурофильных гранул, чем при гипергранулярном варианте ОМЛ М3. В цитоплазме клеток в большинстве случаев содержатся многочисленные палочки Ауэра. Ядра клеток неправильной формы, дольчатые, складчатые, напоминающие ядра клеток при одном из вариантов ОМЛ М5 — ОМЛ М5b.

Некоторые авторы среди случаев ОМЛ М3, подтвержденных цитогенетическим анализом, различают также дополнительные варианты: ОМЛ М3 с базофилией цитоплазмы клеток; М2-подобный вариант с преобладанием среди субстратных клеток промиелоцитов; М1-подобный вариант с преобладанием бластных клеток и немногочисленными промиелоцитами [29].
При цитохимическом исследовании в лейкемических промиелоцитах как при гипергранулярном, так и при гипогранулярном вариантах определяется высокая активность МПО, ХАЭ. Наблюдается интенсивное окрашивание СЧВ. При PAS-реакции в цитоплазме клеток обнаруживается выраженная диффузная окраска. При использовании толуидинового синего отмечается специфическое для данной формы ОМЛ метахроматическое окрашивание цитоплазмы клеток. Активность КФ в лейкемических клетках колеблется от слабой до умеренной. Реакция при определении активности НЭ слабая, ингибируется фторидом натрия. Напротив, при определении активности КНЭ отмечается интенсивное диффузное окрашивание цитоплазмы клеток [2–4]. Палочки Ауэра, содержащиеся в цитоплазме клеток, обнаруживают положительную реакцию при выявлении активности МПО, ХАЭ, КНЭ и окраске СЧВ [19].

Иммунофенотип достаточно специфичен. Позитивны часто антигены CD13, CD33, MPO, CD9, CD64, CD15. Негативны в большинстве случаев антигены HLA-DR, CD34, TdT, CD7, CD10, CD14, CD65, CD117, CD11a, CD11b, ген множественной лекарственной устойчивости [30]. В 96% случаев субстратные клетки имеют следующую антигенную характеристику: CD13+ CD33+ CD14– HLA-DR– CD9+. Следует отметить, что при других вариантах ОМЛ антиген CD9 обычно отсутствует. Часто наблюдается экспрессия антигена CD2, особенно при М3v и варианте с базофилией цитоплазмы [20]. Наличие экспрессии антигена CD2 является прогностически благоприятным признаком, который коррелирует с частотой наступления полной клинико-гематологической ремиссии и продолжительностью жизни пациентов [31].

При цитогенетическом исследовании у большинства больных определяется транслокация t (15; 17), при которой ген рецептора ретиноевой кислоты (RARA) на хромосоме 17p21 сливается с геном одного из факторов транскрипции (ген промиелоцитарного лейкоза PML) на хромосоме 15q22. Получены cпецифические к химерному белку мкАТ PG-M3 [3] и PML (5E19) [32].
Выявление транслокации t (15; 17) имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение. При ОМЛ М3 описаны редкие альтернативные транслокации, при которых пациенты не чувствительны к проведению терапии ретиноидами. Это — t (5; 17) (q32; q21), при которой ген RARA образует химерный транскрипт с геном нуклеофосмина на хромосоме 5q23 [5], и t (11; 17) (q23; q21), приводящая к слиянию гена RARA и одного из факторов транскрипции PLZF на хромосоме 11q23 [32].

ОМЛ М3 в настоящее время считается прогностически благоприятным вариантом. Совершенствуются специфические эффективные схемы терапии заболевания, основанные на применении ретиноидов самостоятельно или в комбинации с цитостатиками (предполагаемый механизм действия — реорганизация и селективная деградация ядерных телец, количество которых резко увеличено в субстратных клетках у больных с ОМЛ М3).

Дифференциальную диагностику обычно проводят при ОМЛ М3v с М5 (активность МПО и ХАЭ во всех субстратных клетках, отсутствие антигена CD14 при М3v), с ОМЛ М2 с гипергранулярными промиелоцитами (отсутствие «faggot»-клеток, активности НЭ и КНЭ, экспрессии антигена CD9 и транслокации t (15; 17) при ОМЛ М2).

Дифференциальный диагноз с ОМЛ М4 основывается на анализе цитоморфологических и цитохимических признаков лейкемических клеток. При ОМЛ М4 часть бластов обнаруживает отрицательную реакцию при выявлении -НЭ и КНЭ, слабую или отрицательную реакцию при определении активности МПО и ХАЭ [3, 4]. Малые гипербазофильные промиелоциты при ОМЛ М3v в некоторых случаях могут напоминать микромегакариоциты при ОМЛ М7, однако последние всегда отрицательно реагируют при цитохимическом выявлении активности МПО и ХАЭ.

ОМЛ М4 (острый миеломоноцитарный лейкоз)

ОМЛ М4 — одна из наиболее частых форм ОМЛ, встречающаяся у 10–25% больных.

Полагают, что для этой формы заболевания характерна одновременная пролиферация родоначальных (бластных) клеток нейтрофильного и моноцитарного ряда [1]. Существует также мнение, что в основе развития ОМЛ М4 лежит лейкемическая трансформация клетки-предшественника гранулоцитарного и моноцитарного ряда, так называемой КОЕ-ГМ.

ОМЛ М4 встречается у больных разных возрастных групп, но чаще у лиц среднего и пожилого возраста. Средний возраст пациентов во время установления диагноза — 50–52 года. Наиболее частые клинические симптомы — общая слабость, лихорадка, гиперплазия слизистой оболочки десен, геморрагические проявления. Признаки гепатоспленомегалии обнаруживаются у 30–35% больных, лимфаденопатии — у половины пациентов. В ряде случаев наблюдается лейкемическая инфильтрация кожи и мягких тканей [1, 6]. Почти у 90% больных ОМЛ М4 обнаруживают признаки анемии. У 50% пациентов уровень гемоглобина ниже 10 г/дл. Постоянным признаком является также тромбоцитопения. У 50% больных количество тромбоцитов в периферической крови не превышает 50•109/л [1]. Лейкоцитоз (средний показатель 46•109/л) выявляют у 85% больных. У 10% пациентов с ОМЛ М4 в начальный период обнаруживают признаки лейкопении.

Критерием, необходимым для установления диа­гноза ОМЛ М4, служит обнаружение в костном мозге не менее 30% бластных клеток с цитоморфологическими признаками миелобластов I и II типа, монобластов и промоноцитов. Моноцитарный компонент (от монобластов до моноцитов) в костном мозге составляет не менее 20% всех неэритроидных кроветворных клеток, а в периферической крови — не менее 5•109/л [1].

Монобласты, являющиеся субстратными клетками при ОМЛ М5а и составляющие часть клеточной популяции при ОМЛ М4 (от 30 до 70%), по размеру крупнее, чем миелобласты. Некоторые из этих клеточных форм достигают 40 m в диаметре. Монобласты имеют довольно обширную цитоплазму, в которой разбросано варьирующее число азурофильных гранул. Ядра клеток округлой или овальной формы с нежной структурой хроматина, содержат одно или несколько ядрышек. Наряду с ними в периферической крови могут обнаруживаться и несколько более дифференцированные клетки моноцитарно/макрофагального ряда — промоноциты. И монобласты, и промоноциты могут быть чрезвычайно полиморфными.

Миелобласты и незрелые клетки гранулоцитарного ряда, обнаруживающиеся в костном мозге и периферической крови, по цитоморфологическим признакам подобны таковым при ОМЛ М2. Приблизительно в 60% случаев в цитоплазме миелобластов обнаруживаются палочки Ауэра.

Существенное значение для диагностики ОМЛ М4 имеют результаты цитохимических исследований. При этом часть бластов приобретают признаки, характерные для клеток гранулоцитарного ряда, а другие, считающиеся маркерными для клеток, — относящиеся к системе мононуклеарных фагоцитов. Так, миелобласты обнаруживают умеренную и выраженную реакцию при определении активности МПО и ХАЭ, окрашиваются СЧВ. В то же время для монобластов типична выраженная реакция на -НЭ, ингибирующаяся фторидом натрия, и особенно на КНЭ. Реакция на ХАЭ отрицательная, на МПО — отрицательная или слабоположительная. При выполнении PAS-реакции в миелобластах наблюдается диффузное окрашивание цитоплазмы, а в монобластах — отложение конечного продукта реакции в виде нежных гранул.

При проведении иммунофенотипирования имеет значение выявление, в дополнение к миелобластам (CD13+, CD33+), популяции монобластов с экспрессией антигенов CD14, CD64, CD11b, CD11c. В целом бластные клетки обычно реагируют с антителами к антигенам CD13, CD33, CD14, CD15, CD64, CD65, CD117, HLA-DR. Высокая частота экспрессии антигена CD4 в значительной мере указывает на моноцитоидную направленность дифференцировки бластов.

Дифференциальный диагноз ОМЛ М4 чаще всего проводят с такими заболеваниями, как ОМЛ М2, ОМЛ М5b и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) в стадии трансформации в острый лейкоз. При ОМЛ М2 количество клеток моноцитарного ряда менее 5•109/л, а в костном мозге менее 20%, что подтверждается результатами цитохимических исследований. При ОМЛ М5b содержание клеток моноцитарного ряда в костном мозге составляет не менее 80%. При ХММЛ в стадии трансформации содержание клеток с признаками монобластов и промоноцитов составляет менее 30% [1, 2].

В 15–30% случаев при ОМЛ М4 отмечается повышенное (более 3%) содержание незрелых и зрелых эозинофилов в костном мозге без одновременного увеличения их количества в периферической крови.

ОМЛ М4Эо с повышенным содержанием эозинофилов в костном мозге, выделяемый в качестве подварианта ОМЛ М4, ассоциирован с inv(16) (p13q22) и t (16; 16) (p13; q22). Крайне редко inv(16) (p13q22) встречается при ОМЛ М2 и М4 без эозинофилии, МДС, бластном кризе ХМЛ. Описано несколько стабильных химерных белков, образующихся в результате транслокации [16]. Специфических признаков бластные клетки при М4Эо не имеют, однако обычно они коэкспрессируют антигены CD13, CD34, CD36. Часто также наблюдается экспрессия антигенов CD2 и CD19. К химерному белку, образующемуся в результате транслокации, получены поликлональные антитела [33]. Эозинофильные лейкоциты имеют признаки атипии (гипосегментация ядра, крупные и утолщенные ядра, более крупная и несколько базофильная зернистость в цитоплазме) и обладают активностью ХАЭ, в отличие от эозинофилов в норме и при ОМЛ М2Эо.

ОМЛ М4Эо — прогностически благоприятный подвариант, больные чаще молодого возраста. У более 60% из них отмечается положительный ответ на стандартные полихимиотерапевтические схемы по сравнению с 30% больных ОМЛ в целом, что ряд авторов связывает со сниженной способностью бласт­ных клеток к репарации ДНК в ответ на повреждение [34]. Основное значение для диагностики имеет выявление специфических хромосомных аберраций, при этом предпочтение отдается ЦПР [35].

Охарактеризован и другой подвариант ОМЛ М4, ассоциированный с транслокацией t (8; 16) (p11; p13). На его долю приходится около 1% всех случаев ОМЛ, он включает, кроме М4, также и случаи ОМЛ М5а с такой же транслокацией. Основной особенностью бластных клеток при этом является способность к эритрофагоцитозу. Подвариант выделяется в основном на основании наличия указанной хромосомной аномалии. Прогноз при этом плохой. Фенотип бластных клеток: CD33+ CD13+/– CD15+ CD14+/– HLA-DR+ CD34– TdT– CD56+/–.

Редко встречается прогностически неблагоприятный подвариант с повышенным количеством базофилов в пунктате костного мозга — ОМЛ М4Baso.

ОМЛ М5 (острый моноцитарный лейкоз)

При данной форме острого лейкоза более 80% клеток костного мозга представлены монобластами и промоноцитами. С учетом количества монобластов, обнаруживаемых в периферической крови и в лейкемических инфильтратах костного мозга, выделяют два основных цитологических варианта заболевания: острый монобластный лейкоз (ОМЛ М5а), при котором не менее 80% моноцитоидных клеток являются наименее дифференцированными (монобластами), и острый моноцитарный лейкоз (ОМЛ М5b), при котором содержание бластов значительно ниже.
ОМЛ М5а составляет 5–8% всех случаев ОМЛ [6]. Заболевание чаще встречается в молодом возрасте. 75% больных составляют лица моложе 25 лет. Признаки гепатоспленомегалии обнаруживаются у 50% больных, лимфаденопатии — у 30%. Нередко обнаруживаются экстрамедуллярные очаги лейкемической инфильтрации в коже, в ткани яичка ретробульбарные и т.д. Анемия при обследовании больных определяется в 80%, тромбоцитопения — в 70% случаев. Количество лейкоцитов в периферической крови в этот период может быть в пределах нормы, повышенным или сниженным. Почти у половины больных в сыворотке крови определяется повышенный уровень лизоцима.

Монобласты, определяемые в мазках из пунктата костного мозга, крупные (40–50 m в диаметре), с обширной цитоплазмой с варьирующей степенью базофилии, образующей псевдоподии. В вакуолизированной цитоплазме клеток часто обнаруживаются неж­ные или более плотные азурофильные гранулы. Ядра монобластов округлые или овальные, содержащие одно четко различимое ядрышко. В части клеток могут обнаруживаться признаки созревания в промоноциты. Могут выявляться единичные зрелые моноциты. В типичных монобластах палочки Ауэра обычно не выявляются. Они могут обнаруживаться в немногочисленных миелобластах, определяющихся в мазках кост­ного мозга больных с ОМЛ М5а. Помимо указанных типичных лейкемических монобластов, у некоторых больных определяют бласты меньшего размера с умеренно базофильной цитоплазмой, напоминающие лимфобласты. Истинная природа этих клеток может быть установлена только на основе использования маркерных цитохимических реакций и мкАТ к антигенам клеток моноцитарно/макрофагального ряда.

Монобласты при ОМЛ М5а дают варьирующую по степени интенсивности (чаще выраженную) положительную реакцию при выявлении активности -НЭ и КНЭ и отрицательную реакцию при определении активности ХАЭ. Типичным является полное ингибирование активности -НЭ и КНЭ фторидом натрия. Монобласты обычно не содержат МПО и не окрашиваются СЧВ, хотя в некоторых случаях может быть слабая реакция на МПО. Интенсивность реакции на МПО не связана с числом азурофильных гранул в цитоплазме монобластов. Характер PAS-реакции может быть различным. В большинстве случаев наблюдается слабое окрашивание монобластов, у некоторых больных в цитоплазме лейкемических клеток продукты PAS-реакции обнаруживаются в виде многочисленных мелких гранул. Активность КФ в монобластах умеренная, ингибируется ионами тартрата.

К иммунологическим маркерам ОМЛ М5 относят экспрессию антигенов CD14, CD15, CD11b, CD11c, CD4, CD7, в дополнение к экспрессии антигенов CD13, CD33. Типичен следующий иммунофенотип: CD34– CD33+ CD13+ CD15+ CD14+ HLA-DR+ TdT– CD117+/–; на основании экспрессии антигенов CD34, CD15 и CD14 можно выделить монобласты различной степени зрелости: CD34+ CD15+ CD14–; CD34– CD15+ CD14–; CD34– CD15+ CD14+ [36]. Часто встречается коэкспрессия антигенов CD4 и CD7, причем коэкс­прессия антигенов CD7 и CD14 характерна для наиболее неблагоприятного течения процесса [37].

Подтип ОМЛ М5а, ассоциированный с транслокацией t (9; 11) (p21–22; q23), составляет до 4% всех случаев ОМЛ. Реже эта транслокация встречается при ОМЛ М5b и М4, крайне редко — при ОМЛ М1, М2 и М7, а также ОЛЛ. Преобладает у детей младшего возраста. Прогноз в целом неблагоприятный, несколько лучше у взрослых, чем у детей. Бластные клетки обычно не имеют антигенов CD34, CD13, TdT и в то же время коэкспрессируют антигены CD65, CD15, CD14, CD64. В 81% случаев этот фенотип коррелирует с наличием t (9; 11) [38]. Среди других антигенов примерно в половине случаев отмечена экспрессия CD11b, CD11c, CD7, CD4. В исследовании других авторов у 80–100% пациентов бластные клетки экспрессировали антигены CD33, CD13, CD15, HLA-DR, CD11b, CD4, CD38, CD64, а экспрессия CD34, CD56, CD3, CD2, CD7 была отмечена лишь в незначительной части случаев. Экспрессия лимфоидных маркеров не влияла на клиническое течение заболевания [39]. Как и в других случаях, при которых отмечается перестройка хромосомы 11q23, клетки реагируют с моноклональным антителом NG2, направленным к эпитопу хондроитинсульфата [40].

В группе ОМЛ М5а следует также указать на подтип заболевания, ассоциированный с транслокацией t (4; 11) (q21; 23), которая встречается в основном при ОЛЛ L1–L2 с фенотипом ранних В-клеток-предшественников и билинейно-бифенотипическом лейкозе­. Случаи острого лейкоза с наличием подобной транслокации могут быть выделены в отдельную нозологиче­скую группу, так как они имеют близкую клиническую картину, значительно чаще встречаются у детей в возрасте до 1 года, сочетаются с выраженной гепато- и спленомегалией, гиперлейкоцитозом. Прогноз плохой. Практически во всех случах клетки имеют уникальный фенотип: CD19+ CD10– HLA–DR+ TdT+, почти всегда — CD15+, реагируют с мкАТ NG2, иногда CD13–, CD33, CD65-позитивны. Экспрессия других антигенов не­характерна. При цитохимическом исследовании в части бластных клеток выявляется активность МПО, в части — -НЭ и КНЭ.

Дифференцировать ОМЛ М5а следует с ОМЛ М4 и М3v, реже с ОМЛ М0, М1 и М7.

ОМЛ М5b представляет собой разновидность острого моноцитарного лейкоза с более высоким уровнем дифференцировки лейкемических клеток. Частота ОМЛ М5b составляет 3–6% всех случаев ОМЛ [6, 18]. Заболевание чаще встречается у лиц в возрасте старше 50 лет. Гепатоспленомегалия и лимфаденопатия отмечается у 50% больных, экстрамедуллярные очаги поражения (инфильтрация кожи и слизистой оболочки десен) — в 30% случаев. Практически у всех бльных наблюдается анемия, у 80% — тромбоцитопения, у половины больных лейкоцитоз (у 30% пациентов выше 100•109/л).

В составе лейкемических инфильтратов в костном мозге преобладающим типом клеток являются промоноциты, по степени созревания занимающие промежуточное положение между монобластами и моноцитами. Промоноциты — крупные клетки с обширной бледно-голубой цитоплазмой, содержащей азурофильные гранулы. Ядра клеток дольчатые, структура хроматина относительно нежная. Ядрышки не столь отчетливо различимы. Количество монобластов и миелобластов, как правило, не превышает 10–15%. В миелобластах могут обнаруживаться палочки Ауэра. У ряда больных определяются признаки дисгранулоцитопоэза, дисэритропоэза и дисмегакариоцитопоэза. В периферической крови содержание бластов невелико. Как и в костном мозге, преобладают промоноциты. Количество моноцитов небольшое.

При цитохимическом исследовании мазков крови и костного мозга больных с ОМЛ М5b определяется характерная для клеток моноцитарного ряда высокая активность -НЭ и КНЭ, ингибирующаяся фторидом натрия. Столь же выраженной является активность КФ, чувствительной к ингибированию ионами тартрата. Активность ХАЭ не определяется. Реакция на МПО может быть отрицательной или положительной, но не столь выраженной, как в миелобластах или промиелоцитах. При PAS-реакции в цитоплазме клеток наблюдается отложение мелких гранул конечного продукта реакции.

Дифференциальный диагноз проводят в основном с ОМЛ М3v и ОМЛ М4. При ОМЛ М3v лейкемические клетки могут иметь дольчатые ядра, напоминающие ядра промоноцитов и моноцитов. Решающее значение в дифференциальной диагностике указанных разновидностей ОМЛ имеют результаты цитохимических реакций определения активности МПО, -НЭ и КФ. ОМЛ М5b отличается от ОМЛ М4 по содержанию клеток моноцитарного ряда: выше 80% в первом случае и ниже 80% — во втором. Моноцитарная природа клеток при этом должна быть подтверждена результатами цитохимических исследований.

ОМЛ М6 (эритролейкоз)

В соответствии с критериями ФАБ-классификации диагноз ОМЛ М6 устанавливают в случаях, когда эритробласты составляют не менее 50% всех ядросодержащих кроветворных клеток костного мозга, а содержание миелобластов превышает 30% неэритроидных клеток [1, 2].

ОМЛ М6 — относительно редкое заболевания, на его долю приходится до 5% всех случаев ОМЛ. Встречается во всех возрастных группах, но более часто у лиц пожилого возраста. Практически у всех больных наблюдаются анемия и тромбоцитопения. Общее количество лейкоцитов может быть нормальным, сниженным или довольно высоким. Гиперплазия печени, селезенки и лимфатических узлов отмечается у 20–25% больных.

Картина периферической крови и костного мозга может быть чрезвычайно разнообразной, так как она во многом обусловлена характером пролиферации проэритробластов и базофильных эритробластов. Эритроидные клетки могут быть относительно мономорфными с учетом размера, характеристики ядра и цитоплазмы, или же иметь ряд аномалий, таких, как наличие гигантских форм, асинхронность в созревании ядра и цитоплазмы, дольчатое строение ядер, наличие двухъядерных клеток, признаков кариорексиса, вакуолизации цитоплазмы. Многоядерность или многодольчатость ядер могут определяться в клетках эритробластического ряда на всех стадиях их развития. В некоторых случаях эритропоэз может быть мегало­бластическим, в других — макронормобластическим. В аномальных эритроидных клетках-предшественниках могут наблюдаться признаки фагоцитоза, особенно эритрофагоцитоза. При ОМЛ М6, как и при ряде других форм ОМЛ, обнаруживаются миелобласты I и II типа. Примерно у 60% больных в цитоплазме миелобластов определяются палочки Ауэра. В ряде случаев в клетках гранулоцитарного и мегакариоцитарного ряда могут определяться диспластические изменения.

В периферической крови могут определяться многочисленные клетки эритробластического ряда на разных стадиях созревания, в том числе полихроматофильные и оксифильные нормобласты, и незрелые клетки гранулоцитарного ряда.

Предлагают выделять два подварианта: ОМЛ М6а, при котором бластные клетки в основном относятся к миелобластам I и II типа и клеткам-предшественникам эритроидного ряда, и ОМЛ М6b, представляющий опухолевую пролиферацию клеток, коммитированных к дифференцировке исключительно в эритроидном направлении. При этом миелобласты отсутствуют [41, 42].
При проведении цитохимических исследований эритроидные клетки при ОМЛ М6а PAS-положительны, причем типично распределение конечных продуктов реакции в виде крупных гранул или блоков. В них определяется активность КФ, -НЭ и КНЭ в зоне аппарата Гольджи. Морфоцитохимические и иммунофенотипические характеристики миелобластов при ОМЛ М6а не имеют каких-либо особенностей по сравнению с другими формами ОМЛ. Дифференциальный диагноз обычно проводится с МДС, рефрактерной анемией с избытком бластов в стадии трансформации, основной критерий — оценка содержания бластных клеток в пунктате костного мозга.

При ОМЛ М6b бластные клетки относятся к ранним-предшественникам эритропоэза (предположительно бурст и колониеформирующим единицам эритроцитов). Клетки среднего и крупного размера, с округлым ядром, содержащим 1–2 ядрышка, базофильной цитоплазмой с наличием вакуолей и выростов. В более зрелых клетках эритроидного ряда присутствуют признаки дисплазии, мегалобластоидные черты. Реакция на МПО, ХАЭ отрицательна, активность КФ, НЭ и КНЭ возможна в области аппарата Гольджи. PAS-реакция обычно позитивна в виде отложения крупных блоков в цитоплазме клеток. Наименее зрелые бласты могут быть цитохимически инертны. Основным для их идентификации является определение экспрессии поверхностных антигенов: CD36, гликофорина А и В, CD71, CD33, спектрина, антигенов групп крови, CD117. Антигены HLA-DR, CD13, CD34, CD14, TdT, CD15 обычно не выявляются. Активность МПО с помощью мкАТ также не определяется. Дифференцировать заболевание необходимо с ОМЛ М0 и М7 (бластные клетки при этом имеют специфический иммунологический фенотип), а также с В12/фолиево­дефицитной анемией.

Специфические генетические аномалии для ОМЛ М6 не описаны.

ОМЛ М7 (острый мегакариобластный лейкоз)

ОМЛ М7 — одна из форм заболевания, при которой преобладающую часть популяции бластов составляют трансформированные родоначальные клетки мегакариоцитарного ряда. Критериями для диагностики ОМЛ М7, как и других разновидностей ОМЛ, является наличие в мазках из пунктатов костного мозга не менее 30% бластов (от общего числа всех ядросодержащих мегакариоцитов). При этом не менее 50% бластов долж­ны иметь признаки клеток мегакариоцитарного ряда, подтвержденные результатами иммуноцитологических исследований с мкАТ к линейно-специфическим антигенам, данными электронномикроскопического и ультраструктурно-цитохимического анализа [1, 2].
ОМЛ М7, на долю которого приходится 2–4% всех случаев ОМЛ, встречается во всех возрастных группах. У больных нередко выражены признаки гепатоспленомегалии и лимфаденопатии. У части пациентов при рентгенографии выявляются литические поражения костей скелета. У всех больных отмечается анемия. Количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови может быть в пределах нормы, повышенным и сниженным.

Цитоморфологические признаки бластов костного мозга у больных ОМЛ М7 могут быть довольно разнообразными — от клеток типа недифференцируемых бластов и лимфобластов небольшого размера до крупных клеток с обширным ободком цитоплазмы, содержащей азурофильные гранулы в перинуклеарной зоне. В редких случаях наблюдаются признаки мегакариоцитарной дифференцировки и выявляются промегакариоциты. Зрелые мегакариоциты при ОМЛ М7 обычно значительно меньше нормальных мегакариоцитов (7–10 m), ядра их не имеют дольчатого строения. Мегакариобласты и промегакариоциты обычно располагаются изолированно, но иногда в виде небольших кластеров, симулирующих метастатические поражения костного мозга. При ОМЛ М7, как и при ряде других форм ОМЛ, могут наблюдаться признаки вовлечения в процесс родоначальных клеток гранулопоэза и структурные нарушения в клетках эритробластического ряда. В трепанобиоптатах костного мозга у больных с ОМЛ М7 обнаруживается увеличенное количество ретикулиновых волокон, особенно в перинуклеарном пространстве и паратрабекулярных зонах.

Коллагеновые волокна и фиброз встречаются нечасто.

В мазках периферической крови при ОМЛ М7 обнаруживается мономорфная популяция бластов типа недифференцируемых или имеющих минимальные дифференцировочные признаки клеток мегакариоцитарного ряда. У больных с повышенным количеством тромбоцитов они могут быть крупными, неправиль­ной формы, частично или полностью лишенными гранул. В крови больных могут обнаруживаться также немногочисленные незрелые клетки гранулоцитарного и эритробластического ряда.

При цитохимическом исследовании бластные клетки, обнаруживаемые в костном мозге и периферической крови больных, дают отрицательную реакцию при выявлении активности МПО и ХАЭ, не окрашиваются СЧВ. В них отмечается активность КНЭ, более выраженная, чем -НЭ, и также ингибирующаяся фторидом натрия. Активность тартратчувствительной КФ выявляется в виде диффузно-гранулярной окраски цитоплазмы бластов. При выполнении PAS-реакции наблюдается отложение гранул на фоне диффузной окраски цитоплазмы клеток [3, 4].
Определяющими в современных условиях для выделения ОМЛ М7 являются результаты иммуноцитохимических исследований. Признаками мегакариоцитарной направленности дифференцировки считаются экспрессия антигенов CD41, CD42, CD61, CD36. Реакции с мкАТ к антигенам МПО, CD34, TdT, HLA-DR, CD117, CD14, CD15 обычно отрицательны на основной части бластов. Однако при изучении минорной субпопуляции CD34+-клеток у трети больных выявляется коэкспрессия антигена CD61, гликофорина А и отсутствие антигена CD38, что нехарактерно для других типов ОМЛ (даже для ОМЛ М6) [43]. В части случаев обнаруживается экспрессия антигенов CD13, CD33.

У взрослых специфические транслокации не описаны, за исключением inv(3) (q21; q26) или t (3; 3) (q21; q26), которые, однако, встречаются и при других типах заболевания, за исключением ОМЛ М3, но превалируют при ОМЛ М7. В целом подобные аномалии найдены примерно в 1% всех случаев ОМЛ. Подтип имеет клинические особенности: нормальное содержание тромбоцитов (у трети больных) и даже гипертромбоцитоз (у части пациентов), обнаружение признаков дисплазии в трех ростках кроветворения, наличие псевдопельгеровской аномалии лейкоцитов, частое увеличение содержания базофилов и эозинофилов. Предполагается, что в основе его развития лежит трансформация полипотентной стволовой клетки. Прогноз плохой. У детей раннего возраста (медиана — менее 1 года жизни) описан ОМЛ М7, ассоциированный с транслокацией t (1; 22) (p13; q13). Следует также отметить, что это — один из наиболее частых видов острого лейкоза у детей с синдромом Дауна [44, 45].

Дифференциальную диагностику проводят с ОМЛ М0, М1, М5а, острым базофильным лейкозом, ОЛЛ L1 и ОЛЛ L2. Для этих целей, как правило, используют результаты цитохимических и иммуноцитохимических исследований. ОМЛ М7 необходимо также дифференцировать с метастатическими поражениями костного мозга, особенно это важно у детей с метастазами невробластомы в костный мозг.

В соответствии с новой классификацией ВОЗ в группе ОМЛ выделяют также острый панмиелоз с миелофиброзом [5]. Это форма заболевания, диагностировавшаяся ранее как острый миелофиброз или острый миелосклероз [46], является панмиелопатией с вовлечением клеток эритробластического ряда, гранулоцитов и мегакариоцитов. Она характеризуется гиперплазией незрелых клеток всех трех основных линий костномозгового кроветворения и варьирующей степенью фиброза. Эту разновидность ОМЛ приходится дифференцировать с теми случаями ОМЛ М7, при которых имеются минорный эритроидный и гранулоцитарный компоненты и отмечается фиброз костного мозга. В таких случаях помогает установление мегакариоцитарной направленности дифференцировки преобладающей мономорфной популяции бластных клеток.

В целом необходимо подчеркнуть, что для выделения различных форм ОМЛ в большинстве случаев нужно основываться на анализе цитоморфологических и цитохимических признаков бластных клеток. Все более широкое применение иммуноцитохимических методов с использованием панелей мкАТ, несомненно, способствует более глубокому познанию природы лейкемических клеток и уточненному выделению отдельных форм заболевания.

Обобщая данные по экспрессии антигенов на бласт­ных клетках при различных формах ОМЛ, следует отметить следующее.

Определение активности МПО с помощью мкАТ позволяет охарактеризовать ОМЛ М0–М5. Бластные клетки при ОМЛ М6 и М7 МПО-отрицательны. Для идентификации последних особое значение имеют антитела к антигенам клеток-предшественников эритро- и мегакариоцитопоэза.

Панмиелоидные антигены CD33, CD13, CD117 экспрессируются в большинстве случаев ОМЛ М0–М6. Подтипы ОМЛ М2 с t (8; 21), M4 c t (8; 16), M5a c t (9; 11) и t (4; 11) чаще, чем аналогичные варианты без указанных транслокаций, CD13-негативны. Экс­прессия CD13 не обнаруживается в большинстве случаев М6, а экспрессия CD13 и CD33 — при ОМЛ М7. Антиген CD117 часто отсутствует при ОМЛ М3.

Реакция на антиген CD34 положительна в большинстве случаев при ОМЛ М0, М1, М4, в особенности при М4Эо, при ОМЛ М2 — в трети случаев, особенно при t (8; 21), при М5 — в 20% случаев. В основном отсутствует при ОМЛ М3, М2Вaso, М4Baso, ОМЛ М4 с t (8; 16), ОМЛ М5 с t (9; 11), ОМЛ М6 и М7.
Активность TdT присуща бластным клеткам при ОМЛ М0, М1, особенно при транслокации t (9; 22), ОМЛ М2, особенно при t (8; 21). При ОМЛ М2Вaso, М4Baso, ОМЛ М3 — М7 TdT обычно не выявляется. Реакция на антиген HLA-DR положительна при ОМЛ М0, М1, М4, М5, в трети случаев при ОМЛ М2; в основном отсутствует при варианте М3. Непостоянная экспрессия отмечается при ОМЛ М6, М7.

Антиген CD7 экспрессируется на поверхностных мембранах бластов в 10–30% случаев ОМЛ, более часто при вариантах М0, М5 и М1, особенно при транслокации t (9; 22), реже — при ОМЛ М4, редко — при ОМЛ М2; в основном отсутствует при ОМЛ М3, нехарактерен для ОМЛ М6 и М7. Ассоциирован с «незрелым» фенотипом клеток, экспрессией CD34, TdT, HLA-DR, часто — гена множественной лекарственной устойчивости. Экс­прессия антигена CD7 на бластах при ОМЛ М5 имеет негативное значение при определении прогноза заболевания. При других подтипах данные о прогностическом значении антигена CD7 противоречивы. Некоторые авторы указывают, что в группе пациентов с CD7+ ОМЛ чаще встречаются лица молодого возраста, наблюдаются признаки гепато- и спленомегалии, поражение центральной нервной системы, гиперлейкоцитоз, меньше вероятность получения полной ремиссии [37]. Другие исследователи не нашли отличий в особенностях клинического течения.

Экспрессия антигена CD4 выявляется в среднем в 45,9% случаев ОМЛ, а именно: 37,4% — при ОМЛ М1, 33,7% — при ОМЛ М2, 35,4% — при ОМЛ М3, 65% — при ОМЛ М4, 78,3% — при ОМЛ М5. Для CD4+ бластов типичен более «зрелый» фенотип CD34lowCD33highCD11bhighGM-CSRhigh. Почти всегда позитивны случаи с транслокацией 11q23 и inv(16) [48]. По данным этих же авторов, средняя продолжительность жизни больных с CD4+ ОМЛ ниже, чем при отсутствии экспрессии антигена.

Антиген CD2 экспрессируется в среднем в 21% случаев ОМЛ, характерен для ОМЛ М3, особенно М3v и варианта с базофилией цитоплазмы, и для ОМЛ М4Эо. Пациенты с коэкспрессией антигенов CD2 и CD19 на бластных клетках, по сравнению с больными с CD2–CD19–, имеют более высокую частоту полной ремиссии (75 и 59% соответственно) и выживаемости (43,8 и 29,8% на протяжении двух лет наблюдения) [49].

При изучении бластных клеток костного мозга больных с впервые диагностированным ОМЛ экс­прессия антигена CD19 выявляется в 14% случаев [49]. В основном она встречается при ОМЛ М1, особенно при транслокации t (9; 22); при М4Эо; при ОМЛ М2 в 90% случаев совпадает с наличием транслокации t (8; 21). В 3% случаев ОМЛ наблюдается коэкспрессия антигенов CD7 и CD19, причем превалирование CD19+-клеток характерно для t (8; 21) [50].

С помощью антител можно выявить химерные белки и, таким образом, идентифицировать транслокации t (4; 11), t (9; 11), t (15; 17), инверсию хромосомы 16. Для выявления этих, а также других прогностически значимых генетических аномалий, до­статочно удобно использование метода ЦПР.

Литература

1. Brunning RD, McKenna RW. Tumors of the bone marrow. Washihgton: Armed Forces Inst Pathol 1993; 406 p.
2. Bain BJ. Leukemia Diagnosis. Oxford: Blackwell Science Ltd 1999; 200 p.
3. Глузман ДФ. Диагностическая цитохимия гемобластозов. Киев: Наук думка 1978; 216 с.
4. Глузман ДФ, Абраменко ИВ, Скляренко ЛМ, Надгорная ВА. Лабораторная диагностика онкогематологических заболеваний. Киев: Морион 1998; 336 с.
5. Harris NL, Jaffe ES, Diebold J et al. World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical advisory committee meeting. — Airlie House, Virginia, November 1997. J Clin Oncol 1999; 17: 3835.
6. Stanley M, McKenna RW, Ellinger G, Brunning RD. Classification of 358 cases of acute myeloid leukemia by FAB criteria: analysis of clinical and morphological features. In: Bloomfield CD, ed. Chronic and acute leukemias in adults. Boston: Martinus Nijhoff 1985: 147.
7. Bloomfield CD, Brunning RD. The revised French-American-British classification of acute myeloid leukemia: is new better? Ann Intern Med 1985; 103: 614.
8. Bennett JM, Catovsky D, Daniel M-T et al. Proposals for the classification of the acute leukemias (FAB cooperative group). Br J Haematol 1976; 33: 451.
9. Bennett JM, Catovsky D, Daniel M-T et al. A variant form of acute hypergranular promyelocytic leukemia (M3). Br J Haematol 1980; 40: 169.
10. Bennett JM, Catovsky D, Daniel M-T et al. Criteria for the diagnosis of acute leukemia of megakaryocytic lineage (M7): a report of the French-American-British cooperative group. Ann Intern Med 1985; 103: 460.
11. Bennett JM, Catovsky D, Daniel M-T et al. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. Ann Intern Med 1985; 103: 626.
12. Bennett JM, Catovsky D, Daniel M-T et al. Proposal for the recognition of minimally differentiated acute myeloid leukemia (AML M0). Br J Haematol 1991; 78: 325.
13. Scott CS, den Ottolander GJ, Swirsky D et al. International Council for Standartization in Haematology (ICSH). Recommended procedures for the classification of acute leukemias. Leuk Lymphoma 1995; 18, Suppl 1: 1.
14. Loffler H, Rastetter J. Atlas Hematology, 5th ed. Berlin etc: Springer-Verlag 1999; 415 p.
15. Cheson BD, Cassileth PA, Head DR et al. Report of the National Cancer Institute-sponsored workshop on defini­tion of diagnosis and response in acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 1990; 8: 813.
16. Френкель МА, Тупицын НН, Волкова МА, Флейш­ман ЕВ. Острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой. Гематол трансфузиол 1998; 4: 9.
17. Bene MC, Bernier M, Casasnovas RO et al. The reliability and specificity of c-kit for the diagnosis of acute myeloid leukemias and undifferentiated leukemias. The European Group for the Immunological Classification of Leukemias (EGIL). Leukemia 1998; 12: 54.
18. Groupe Francais de morphologie Hematopogique. French registry of acute leukemia and myelodysplastic syndromes. Age distribution and hemogram analysis of the 4496 cases recorded 1982–1983 and classified according to FAB criteria. Cancer 1987; 60: 1385.
19. Hayhoe FGJ, Quaglino D. Haematological Cytochemistry. Sec. Ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 1988. 567 p.
20. Casasnovas RO, Campos L, Mugneret F et al. Immuno­pheno­typic patterns and cytogenetic anomalies in acute non-lymphoblastic leukemia subtypes: a prospective study of 432 patients. Leukemia 1998; 12: 34.
21. Бене МК, Кастолди Г, Нанн В. Предложения для иммунологической классификации острых лейкозов. Гематол трансфузиол 1996; 41: 43.
22. Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis of hematologic malignancy. Blood 1997; 90: 2863.
23. Nakamura H, Kuriyama K, Sadamori N et al. Morphological subtyping of acute myeloid leukemia with maturation (AML-M2): homogeneous pink-colored cytoplasm of mature neutrophils is most characteristic of AML-M2 with t (8; 21). Blood 1991; 78: 2962.
24. Tisone JA, Bohman JE, Theil KS, Brandt JJT. Aberrant expression of CD19 as a marker of monocytic lineage in acute myelogenous leukemia. Am J Pathol 1997, 107: 283.
25. Appelbaum FR. Molecular diagnosis and clinical decisions in adult acute leukemia. Semin Hematol 1999; 36: 401.
26. Brunel V, Lafage-Pochitaloff M, Alcalay M et al. Variant and masked translocations in acute promyelocytic leukemia. Leuk Lymphoma, 1996, 22: 221.
27. Marcucci G, Livak KJ, Bi W et al. Detection of minimal residual disease in patients with AML1/ETO-associated acute myeloid leukemia using a novel quantitative reverse transcription polymerase chain reaction assay. Leukemia 1998, 12: 1482.
28. Alsabeh R, Brynes RK, Slovak ML, Arber DA. Acute myeloid leukemia with t (6; 9) (p23; q34): association with myelodysplasia, basophilia, and initial CD34 negative immunophenotype. Am J Clin Pathol 1997; 107: 430.
29. Neame PB, Soamboonsrup P, Leber B et al. Morphology of acute promyelocytic leukemia with cytogenetic or molecular evidence for the diagnosis: characterization of additional microgranular variants. Am J Hematol 1997; 56: 131.
30. Paietta E, Andersen J, Gallagher R et al. The immuno­phenotype of acute promyelocytic leukemia (APL): an ECOG study. Leukemia 1994, 8: 1108.
31. Guglielmi C, Martelli MP, Diverio D et al. Immunophenotype of adult and childhood acute promyelocytic leukemia: correlation with morphology, type of PML gene breakpoint and clinical outcome. A cooperative Italian study on 196 cases. Br J Haematol 1998; 102: 1035.
32. Mattson GC. Acute promyelocytic leukemia. From morphology to molecular lesions. Clin Lab Med 2000; 20: 83.
33. Viswanatha DS, Chen IM, Liu PP et al. Characterization and use of an antibody detecting the CBF-SMMHC fusion protein in inv(16)/t (16; 16)-associated acute myeloid leukemias. Blood 1998; 91: 1882.
34. Britos-Bray M, Ramirez M, Cao W et al. CBFb-SMMMHC, expressed in M4Eo acute myeloid leukemia, reduced p53 induction and slows apoptosis in hematopoietic cells exposed to DNA-damaging agents. Blood 1998; 92: 4344.
35. Kojima K, Omoto E, Hara M et al. Myelodysplastic syndrome with translocation (8;21): a distinct myelodysplastic syndrome entity or M2 acute myeloid leukemia with extensive myeloid maturation? Ann Hematol 1998; 76: 279.
36. Белоус НИ. Поверхностные антигены бластных клеток при острых лейкозах миелоидного происхождения. Авт … канд биол наук. Киев 1998, 16 с.
37. Del Poeta G, Stasi R, Venditti A et al. Prognostic value of cell marker analysis in de novo acute myeloid leukemia. Leukemia 1994; 8: 388.
38. Creutzig U, Ritter J, Ludwig WD et al. Klassifikation der AML nach morphologischen, immunologischen und cyto­genetischen Kriterien. Klin Paediatr 1993; 205: 272.
39. Тупицын НН, Попа АВ, Маркина ИГ и др. Клиническое значение иммунофенотипа острых миелобластных лейкозов. Гематол трансфузиол 1999; 3: 3.
40. Smith FO, Rauch C, Williams DE et al. The human homologue of rat NG2, a chondroitin sulfate proteoglycan, is not expressed on the cell surface of normal hematopoietic cells but is expressed by acute myeloid leukemia blasts from poor-prognosis patients with abnormalities of chromosome band 11q23. Blood 1996; 87: 1123.
41. Davey FR, Abraham N, Brunetto VL et al. Morphological characteristics of erythroleukemia (acute myeloid leukemia; FAB M6): a CALGB study. Am J Hematol 1995; 49: 29.
42. Garand R, Duchayne E, Blanchard D et al. Minimally differentiated erythroleukemia (AML M6 «variant»): a rare subset of AML distinct from AML M6. Groupe Francais d’Hematologie Cellulaire. Br J Haematol 1995; 90: 868.
43. Логинский ВЕ, Выговская ЯИ, Масляк ЗВ и др. Значение иммунологического фенотипирования бластных клеток в диагностике острой миелоидной лейкемии у взрослых. Эксперим онкология 1996; 18: 146.
44. Bain BJ. Down’s syndrome — transient abnormal myelopoiesis and acute leukemia. Leuk Lymphoma 1991; 3: 309.
45. Bain BJ. Transient leukemia in newborn infant with Down’s syndrome. Leuk Res 1994; 18: 723.
46. Bearman RM, Pangalis GA, Rappaport H. Acute («malignant») myelosclerosis. Cancer 1979; 43: 279.
47. Baudard M, Legrand O, Marie JP, Zittoun R. Smoldering acute myelogenous leukemia in the elderly. Leuk Lymphoma 1999; 34: 561.
48. Mizutani M, Miwa H, Takahashi T et al. Cellular characteristics of acute leukemia cells simultaneously expressing CD13/CD33, CD7 and CD19. Int J Hematol 1997; 66: 479.
49. Ball ED, Davis RB, Griffin JD et al. Prognostic value of lymphocyte surface markers in acute myeloid leukemia. Blood 1991; 77: 2242.

Дата добавления: 25.01.2021 г.
geoapteka.ua
На нашем сайте используются файлы cookies для большего удобства использования и улучшения работы сайта. Продолжая, вы соглашаетесь с использованием cookies.
Developed by Maxim Levchenko