Експериментальні моделі остеоартрозу (5000157963)

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ МОДЕЛІ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ УШКОДЖЕННЯ ТА РЕПАРАЦІЇ СУГЛОБОВОГО ХРЯЩА IN VITRO

Хрящ — високоспеціалізована тканина, що містить лише один тип клітин (хондроцити), яка характеризується відсутністю кровоносних і лімфатичних судин. Живлення хряща в основному здійснюється шляхом всмоктування із синовіальної рідини. Метаболізм хондроцитів регулюється цілою низкою розчинних факторів, що продукуються локально хондроцитами та навколишніми тканинами. Функція хондроцитів також залежить від складу позаклітинного середовища (напруга кисню, концентрація іонів, рН тощо), складу ПКМ, взаємодії клітин і матрикса, фізичних сигналів. Головним завданням експериментального моделювання є створення культур у позаклітинному середовищі без зміни фенотипу зрілих клітин. Друге завдання — створення культур для вивчення передчасної, відстроченої, короткої чи тривалої відповіді хондроцитів на хімічні та/чи фізичні сигнали. Дослідження in vitro також дають можливість вивчати особливості реакції хондроцитів при ОА. Третім завданням є розвиток кокультуральних систем, що дозволяють вивчати взаємодію різних тканин у суглобі. Четверте завдання — підготовка хрящових імплантатів до подальшої трансплантації. І, нарешті, п’яте завдання — дослідження факторів росту, цитокинів або терапевтичних агентів, які здатні стимулювати репарацію та/чи пригнічувати резорбцію хряща.

За останні десятиріччя створені різні моделі культур клітин суглобового хряща, серед них — багатошарові культури, завислі культури, культури хондронів, експлантати, кокультури, культури безсмертних клітин. Кожна культура має свої переваги та недоліки і кожна підходить для дослідження одного певного аспекту метаболізму хондроцитів. Так, хрящові експлантати — чудова модель для вивчення обороту елементів матрикса, для чого потрібні справжні рецептори клітинної поверхні та нормальні взаємодії клітина — матрикс і матрикс — клітина. Водночас дослідження відкладень у матриксі або механізмів регуляції метаболізму хондроцитів рекомендують проводити на культурі ізольованих клітин. Багатошарова культура низької щільності необхідна для вивчення процесу диференціювання клітин. Культури, завислі у природному чи синтетичному матриксі — модель для аналізу адаптаційної відповіді хондроцитів на механічний стрес.

КУЛЬТУРИ ХОНДРОЦИТІВ

При виборі хрящової тканини для досліджень in vitro необхідно враховувати кілька важливих моментів. Склад матрикса й метаболічна активність хондроцитів варіюють у різних суглобах, а остання також залежить від глибини розташування хондроцитів у тканині. Ці дані одержано в декількох експериментах, у яких вивчали ізольовані субпопуляції хондроцитів із зон хряща різної глибини. Виявлено ряд морфологічних і біохімічних відмінностей між культивованими хондроцитами, розташованими у поверхневих і глибоких шарах суглобового хряща. Поверхневі клітини синтезують рідкий, із незначним вмістом протеогліканів фібрилярний матрикс, тоді як більш глибокі клітини продукують матрикс із значним вмістом фібрил і протеогліканів (Aydelotte M., Kuettner K.E., 1988; Archer C. et al., 1990). Крім того, поверхневі клітини виробляють відносно більше дрібних неагрегованих протеогліканів і гіалуронову кислоту та відносно менше агрекану і кератан сульфату, ніж більш глибоко розташовані хондроцити (Manicourt D., Pita J., 1988; Siczkowski M., Watt F., 1990; Korver T. et al., 1992). Іншою важливою відмінною рисою метаболізму хондроцитів, ізольованих із зон хряща різної глибини, є відповідь на екзогенний стимул. За даними M. Aydelotte та співавторів (1988; 1991) хондроцити бика з поверхневої зони хряща були більш чутливі до ІЛ-1, ніж клітини глибокої зони.

Поведінка клітин також залежить від локалізації тканини. Хондроцити хрящів ребер і вух, взяті від тієї самої тварини, по-різному реагують на фактори росту, такі, як фактор росту фібробластів (ФРФ) і ТФР-β. ФРФ збільшував включення тимідину, проліну і лейцину в культуру хондроцитів ребра, але не вуха. ТФР-β збільшував включення тимідину в хондроцити хряща ребра і вуха, але не впливав на включення тимідину і проліну в хондроцити вуха (Lee J. et al., 1997). Хрящові клітини, отримані із зон, що несуть найбільше навантаження, відрізняються від таких із ділянок з низьким навантаженням на хрящ. Так, хондроцити зрілого хряща колінного суглоба вівці із центральної ділянки суглобової поверхні великогомілкової кістки, не покритої меніском, яка переносить найбільше навантаження in vivo, менше синтезують агрекан, але більше декорин, ніж клітини із зон, покритих меніском (Little C., Ghosh P., 1997). Автори також підкреслюють важливість використання хряща з ідентичних зон суглобів при дослідженні синтетичної функції суглобів.

Метаболізм хондроцитів та їх відповідь на регуляторні фактори також значно залежить від віку донора, розвитку його кістяка та стану суглобів, з яких беруть клітини. З віком у хондроцитів людини спостерігається значне зниження проліферативної відповіді. Найбільше зниження відзначається у донорів віком 40–50 років і старше 60 років (Henroitin Y., Reginster J.Y., 1999). Крім того, вираженість проліферативної відповіді на фактори росту (наприклад ФРФ і ТФР-β) знижується в процесі старіння. Крім кількісних змін проліферації хондроцитів існують ще й якісні зміни. Клітини донорів молодого віку (10–20 років) краще реагують на фактор росту, одержаний із тромбоцитів, ніж на ТФР-β, тоді як протилежне спостерігається у клітинах дорослих донорів (Guerne P.A. et al., 1995). Для пояснення залежних від віку змін синтетичної функції хондроцитів та їх відповіді на дію факторів росту використовують кілька механізмів. Серед них зменшення кількості та афінності поверхневих клітинних рецепторів, зміна синтезу та біоактивності факторів росту і цитокинів, модифікація пострецепторних сигналів.

Патологічний стан суглобів також змінює морфологію та метаболічну активність хондроцитів. Так, J. Kouri та співавтори (1996) ідентифікували три субпопуляції хондроцитів у хрящі при ОА. Хондроцити з поверхневої і верхньої частини середини хряща утворюють скупчення і синтезують більшу кількість протеогліканів і колагену (Lafeber F. et al., 1992; Aigner T. et al., 1997). ТФР-β та ІФР здатні стимулювати синтез протеогліканів хондроцитами та частково нівелювати ефекти ІЛ-1 і ФНП-α. Експлантати хряща, ураженого ОА, і хондроцити, ізольовані із хряща хворого на ОА, більш чутливі до стимуляції ТФР-β, ніж хондроцити здорового хряща. Ці відмінності, найімовірніше, пов’язані з фенотипічними змінами хондроцитів у верхніх шарах суглобового хряща (Lafeber F. et al., 1997).

Ізоляція окремих хондроцитів досягається послідовною обробкою протеолітичними ферментами ПКМ. Після їх вивільнення із ПКМ ізольовані клітини ідеально підходять для дослідження синтезу компонентів матрикса de novo. Деякі автори використовують тільки колагеназу клостридій, інші — попередньо інкубують хрящ із трипсином, проназою, ДНКазою і/або гіалуронідазою. Кількість ізольованих клітин залежить від ферментів, які використовуються. Так, при обробці лише однією колагеназою з 1 г тканини можна одержати 1,4∙106 хондроцитів, тоді як при використанні пронази, гіалуронідази і колагенази — 4,3·106. При обробці колагеназою в культурі клітин залишаються агрекан, білки, ІЛ-6, ІЛ-8 у значно більшій кількості, ніж при послідовній обробці різними ферментами. Існує декілька пояснень цієї різниці між двома клітинними культурами:

• Клітинні рецептори ушкоджені або пригнічені дією ферментів (Loeser R., 1993), ТФР-β інгібує ДНК і синтез протеогліканів у щойно ізольованих хондроцитах (1-й день), тоді як ДНК і синтез протеогліканів хондроцитів, що культивуються у моношарі (7 днів), стимулюються ТФР-β (van der Kraan P. et al., 1992). Проте для реекспресії цих компонентів мембрани необхідний адекватний період, що передує початку експерименту.
• Екзогенні протеази можуть розірвати взаємодію клітин і матрикса, опосередковану інтегринами. Родина інтегринів сприяє фіксації хондроцитів до молекул ПКМ (Shakibaei M. et al., 1997). Цей розрив може вплинути на експресію матричних генів (Hering T. et al., 1994).
• Залишки компонентів матрикса мають здатність регулювати синтетичну функцію хондроцитів. Інтегрини можуть розпізнавати продукти деградації ПКМ, відіграючи важливу роль у репарації тканини після впливу протеолітичних ферментів. T. Larsson та співавтори (1989) повідомили про те, що додавання інтактних або фрагментованих протеогліканів до культури клітин стимулює синтез білків і протеогліканів. Проте високий рівень гіалуронової кислоти викликає значне зниження включення сульфатів у синтез протеогліканів хондроцитами ембріона курчати, зрілими хондроцитами свині та клітинами хондросаркоми щура (Bansal M. et al., 1986). Крім того, гіалуронова кислота — інгібітор вивільнення протеогліканів із клітин навіть у присутності ІЛ-1β, ФНП-α, ФРФ, що свідчить про протидію першій біологічній активності факторів росту і цитокінів (Shimazu M., 1993). Точний механізм, що лежить в основі дії гіалуронової кислоти, залишається не з’ясованим; відомо, що хондроцити містять рецептор до гіалуронової кислоти, пов’язаний з актиновими філаментами цитозолю (Lacy B., Underhill C., 1987; Aruffo A. et al., 1990). Зв’язування гіалуронової кислоти з її рецептором стимулює фосфорилювання білків (Turley E., 1989). Таким чином, ці дані демонструють модулювання метаболічної функції хондроцитів фрагментованими або нативними молекулами матриксних білків шляхом активації мембранних рецепторів клітин.
• Швидка стимуляція ферментами синтезу матриксних протеїнів хондроцитів може бути наслідком зміни форми хондроцитів і/або реорганізації цитоскелету.
• Деякі цитокіни (наприклад ІЛ-8) і фактори росту (наприклад ІФР-1, ТФР-β) фіксуються у ПКМ (Morales T. et al., 1991; Recklies A., Gold E., 1992). Найбільш відомим прикладом є зв’язування ТФР-β декорином, що призводить до зниження здатності першого індукувати клітинний ріст у клітинах яєчника китайських хом’ячків (Yamaguchi Y. et al., 1990). Дані про те, що вміст декорину в хрящі збільшується з віком, свідчать про зниження біодоступності ТФР-β у процесі старіння (Roughley P. et al., 1994). Фактори росту і цитокіни можуть вивільнятися із залишків матрикса під час культивування і в подальшому модулювати функції хондроцитів.

Моношарова культура хондроцитів. Диференційований фенотип хондроцитів насамперед характеризується синтезом колагену ІІ типу і тканиноспецифічних протеогліканів, а також низьким рівнем мітотичної активності. Є дані про те, що при тривалому культивуванні клітин у моношарі, а також після декількох повторних пасажів клітин хондроцити втрачають свої сферичні контури, набувають подовженої, фібробластоподібної форми (von der Mark K. et аl., 1977). При такій фібробластній метаплазії також модифікується синтетична функція клітин, що характеризується прогресуючим зниженням синтезу колагенів ІІ, ІХ і ХІ типу і підвищенням синтезу колагенів І, ІІІ і V типу (Elima K., Vuorio E., 1989; Lefebvre V. et al., 1990). Малі неагреговані протеоглікани синтезуються за рахунок функціонального агрекану (Kuettner K. et al., 1982; Watt F., 1988). Синтез катепсину В та L надзвичайно низький у диференційованих клітинах, але в процесі втрати диференціації підвищується. Колагеназа-1 експресується в диференційованих хондроцитах, при тривалій культивації її експресія знижується, в той час як підвищується продукція тканинних інгібіторів металопротеаз (ТІМП) (Lefebvre V. et al., 1990).

Диференційовані хондроцити реекспресують колаген диференційованого фенотипу при переносі їх з моношарової культури у завислу (Benya P., Schaffer J., 1982; Elima K., Vuorio E., 1989). Процес диференціювання, імовірно, пов’язаний з формою клітин (Loty S. et al., 1995). Ця властивість регулярно використовується дослідниками, які вивчають дефектні трансплантати з аутологічними хондроцитами. Невелику кількість клітин, отриманих із біопсійного матеріалу, можна розмножити у багатошаровій культурі і потім знову помістити у тривимірний матрикс перед трансплантацією. Реекспресію специфічного фенотипу дедиференційованими хондроцитами, перенесеними в агарозну культуру, можна стимулювати ТФР-β, осеїн-гідроксиапатитним комплексом і аскорбіновою кислотою (Harrison E. et al., 1992).

У відповідь на дію цитокінів і факторів росту хондроцити зазнають модифікації під час процесу диференціювання. Клітинна відповідь на цитокіни і фактори росту відрізняються між недиференційованими та диференційованими хондроцитами. ІЛ-1 стимулює проліферацію фібробластів, тоді як ріст недиференційованих хондроцитів пригнічується ІЛ-1 (Guerne P. et al., 1994). Синтез ДНК стимулюється ІФР-1 у подовжених, але не сплощених хондроцитах (Lee D. et al., 1993). У диференційованих хондроцитах стимулювальні ефекти ІЛ-1β і ФНП-α на продукцію проколагенази більше виражені, ніж у недиференційованих (Lefebre V. et al., 1990).

Культивування хондроцитів у зависі в рідкому середовищі — у природному чи синтетичному тривимірному матриксі стабілізує фенотип хондроцита. Клітини зберігають свою сферичну форму, синтезують тканиноспецифічні білки. Завислу культуру хондроцитів зазвичай рекомендують для дослідження утворення нового перицелюлярного матриксу. Культури хондроцитів у синтетичних або природних абсорбуючих полімерах використовують для імплантації клітин у дефекти хряща для стимуляції регенерації хрящової тканини суглоба. Синтетичне або природне середовище для імплантованих клітин має відповідати ряду вимог (Henrotin Y., Reginster J.-Y., 1999):

• імплантати повинні мати пористу структуру для адгезії та росту клітин;
• ні сам полімер, ні продукти його деградації не повинні викликати запалення чи токсичні реакції при імплантації in vivo;
• носій трансплантата повинен мати здатність зв’язуватися із прилягаючим хрящем або субхондральною кісткою;
• природний або синтетичний матрикс повинен мати здатність до абсорбції, його деградація має врівноважуватися регенерацією тканини;
• для полегшення репарації хряща хімічна структура і архітектура пор матрикса має сприяти підтриманню хондроцитами, розміщеними в ньому, клітинного фенотипу і синтезу тканиноспецифічних білків;
• під час імплантації in vivo необхідно вивчити механічні властивості синтетичного або природного матриксу.

Завис хондроцитів у рідкій фазі. Прикріпленню клітин до пластикових судин, у яких здійснюється культивування хондроцитів, можна запобігти покриттям їх стінок розчином метилцелюлози, агарози, гідрогелю (полі-2-гідроксиетилметакрилат) або сумішшю колаген-агароза (Reginato A. et al., 1994). У цих умовах хондроцити формують скупчення і синтезують головним чином агрекан і тканиноспецифічні колагени (II, IX, XI тип). Зазвичай виявляють два типи клітин. Розташовані в центрі клітини зберігають сферичну форму, оточені добре розвиненим ПКМ, що підтверджується даними гістохімічного і ультраструктурного досліджень. На периферії хондроцити мають дископодібні контури, оточені рідким ПКМ; про функціональні особливості таких клітин відомо мало.

Можлива культивація хондроцитів на мікроносіях, що підтримуються у завису; в ролі мікроносіїв використовують декстранові бусини (цитодекс), покриті колагеном декстранові бусини (цитодекс ІІІ), мікросфери коллагену І типу, що не містять пори (целаген) (Freed L. et al., 1993; Fronroza C. et al., 1996). В цих умовах культивування хондроцити прикріплюються до поверхні мікроносія, зберігають свою сферичну форму і продукують матриксоподібний матеріал. Крім того, використання целагену сприяє проліферації хондроцитів і реекспресії нормального фенотипу (Fronroza C. et al., 1996). Тому культивування хондроцитів на мікросферах целагену можна використовувати для відновлення фенотипу клітин перед трансплантацією.

Ще одним методом культивування зависі хондроцитів у рідкому середовищі є їх культивування у вигляді щільних кульок, що складаються із клітин (0,5–1·106), одержаних шляхом центрифугування. Такі хондроцити здатні продукувати матрикс із великим вмістом протеогліканів, колагену II типу, але не колагену I типу, що підтверджено гістологічними, імуногістохімічними і кількісними методами (Xu C. et al., 1996; Ronziere M.-C. et al., 1997).

Завис хондроцитів у природному ПКМ. Хондроцити можна культивувати в завису у тривимірному матриксі (м’який агар, агароза, колагеновий гель або губка, гіалуронова кислота, фібриновий клей, бусини алгінату).

Хондроцити, що культивуються в агарозі, зберігають свій нормальний фенотип і синтезують колаген II типу і тканиноспецифічні агреканові агрегати (Benya P., Schaffer J., 1982). При культивуванні в агарозі синтезовані клітиною протеоглікани виділяються в середовище протягом 50 днів. Для порівняння — у багатошаровій культурі клітинна фаза переповнюється глікозаміногліканами вже в перші 5–6 днів культивування; при культивуванні в середовищі після посилення синтезу й вивільнення глікозаміногліканів у перші 8–10 днів настає залежне від часу їх зменшення (Spirito S. et al., 1993). Проте поведінка хондроцитів при їх культивуванні в агарозі відрізняється від такої в умовах in vivo. В агарозі велика кількість синтезованих агрегатів агрекану містить більш дрібні молекули та у меншій кількості, ніж in vivo (Cornelissen M. et al., 1993). ТФР-β стимулює синтез протеогліканів в експлантаті (Morales T., Roberts A., 1988; Pujol J.-P. et al., 1991), проте знижує синтез агрекану в агарозі (Skantze K. et al., 1985).

Алгінат — лінійний полісахарид, одержаний із коричневої морської водорості. У присутності двовалентних катіонів, таких, як іони Са2+, цей полімер перетворюється на гель. Кожен хондроцит, що потрапив в алгінат, оточений матриксом із негативно заряджених полісахаридів, пори якого можна порівняти з такими в гіаліновому хрящі. Матрикс, який формують хондроцити в бусинах алгіната, складається із двох відділів — тонкого шару клітинно-асоційованого матрикса, що відповідає перицелюлярному і територіальному матриксу, суглобового хряща і більш віддаленого матрикса, еквівалентного міжтериторіальному в нативній тканини. На 30-й день культивування відносний і абсолютний об’єм, що займають клітини, і кожний із двох відділів у бусині алгінату майже повністю ідентичні таким у нативному хрящі (Hauselmann H. et al., 1996; Petit B. et al., 1996). Протягом майже 30 днів хондроцити зберігають свою сферичну форму і продукують агрекан, гідродинамічні властивості якого схожі з такими молекул агрекану в матриксі суглобового хряща, а також колагенові молекули II, IX і XI типу (Mok S. et al., 1994; Petit B. et al., 1996; Platt D. et al., 1997). Водночас, подібно до інших культур-суспензій, на поверхні бусин алгінату наявні сплощені клітини, які виробляють невелику кількість молекул колагену I типу, що безпосередньо вивільняються в середовище і не інкорпоруються у ПКМ (Petit B. et al., 1996). У бусинах алгінату спостерігається помірна проліферація хондроцитів. Після 8 міс культивування в гелі алгінату зрілі хондроцити не втрачають метаболічної активності і продовжують синтезувати тканиноспецифічні колаген I типу і агрекан (Hauselmann H. et al., 1994).

H. Tanaka та співавтори (1984) досліджували дифузійні властивості різних природних молекул в алгінаті і виявили, що молекули масою >70 кД не дифундують через алгінат. Таким чином, культивування клітин в алгінаті підходить для дослідження регуляції біосинтезу матрикса і організації ПКМ. Доступність клітин, що культивуються в алгінаті, дозволяє досліджувати дію пептидних регуляторних факторів і фармакологічних агентів на транскрипційному, посттранскриптиційному і трансляційному рівнях.

Хондроцити також культивують у матриксі з колагенових волокон I і II типу (Schuman L. et al., 1995; Fujisato T. et al., 1996). S. Nehrer та співавтори (1997) порівнювали функціонування хондроцитів собаки в порозних колагеново-протеогліканових полімерних матриксах, що містять колагени різного типу. Вони виявили важливі відмінності в морфології біосинтетичної функції хондроцитів, культивованих у колагенових матриксах, що містять коллаген I і II типу. Клітини в матриксі з колагену II типу зберігали свою сферичну форму, в той час як в колагені I типу мали фібробластоподібну морфологію. Крім того, в матриксі з колагену II типу хондроцити продукували велику кількість глікозаміногліканів. J. van Susante та співавтори (1995) порівнювали властивості хондроцитів, культивованих в алгінаті та колагеновому (I тип) гелі. Автори виявили значне збільшення кількості клітин у колагеновому гелі, проте з 6-го дня культивації клітини втратили характерний фенотип, перетворившись у фібробластоподібні клітини. У гелі алгінату спостерігали зменшення кількості клітин, проте хондроцити зберігали свій нормальний фенотип. У колагеновому гелі кількість протеогліканів, що припадають на одну клітину, була значно більшою, ніж в алгінаті, проте у гелі спостерігали зниження синтезу елементів матриксу, починаючи з 6-го дня культивування, тоді як в алгінаті синтез продовжував зростати.

Твердий тривимірний фібриновий матрикс становить природну речовину, яка підтримує завислі в ньому хондроцити в диференційованому фенотипі. Тривимірний фібриновий матрикс також може використовуватися у ролі носія при трансплантації хондроцитів (Homminga G. et al., 1993). Перевагами фібрину є відсутність цитотоксичності, здатність заповнювати простір, адгезивна здатність (Hendrickson D. et al., 1994; Fortier L. et al., 1997). Шляхом гістологічних і біохімічних досліджень, ауторадіографії, електронної мікроскопії виявлено, що хондроцити у фібриновому гелі зберігають свою морфологію, розмножуються й виробляють матрикс навіть після 2 тиж культивування (Fortier L. et al., 1997). Проте G. Homminga та співавтори (1993) повідомили, що вже після 3 днів культивування починається дезінтеграція фібрину, прогресує дедиференціювання хондроцитів.

Завис хондроцитів у штучному (синтетичному) ПКМ. Імплантати хряща для реконструктивної чи ортопедичної хірургії можуть бути одержані шляхом вирощування ізольованих хондроцитів in vitro у синтетичному біосумісному матриксі.

Культивовані в полігліколевій кислоті хондроцити проліферують і підтримують нормальну морфологію і фенотип протягом 8 тиж. Комплекс хондроцити — полігліколева кислота складається із клітин, глікозаміногліканів, колагенів, має зовнішню колагенову капсулу. Однак у таких імплантатах присутні два типи колагенових молекул — I і II. Імплантати з дедиференційованих серій пасажів хондроцитів мають більшу кількість глікозаміногліканів і колагенів, ніж в імплантатах з первинно недиференційованих хондроцитів (Freed L. et al., 1994b).

L. Freed та співавтори (1993b) порівнювали поведінку культур хондроцитів людини і бика у волокнистій полігліколевій кислоті (ВПГК) і порозній полілактиловій кислоті (ППЛК). Через 6–8 тиж культивації хондроцитів бика у ВПГК або ППЛК автори спостерігали проліферацію клітин і регенерацію хрящового матрикса. У ВПГК хондроцити мали сферичну форму, розташовувалися в лакунах, оточених хрящовим матриксом. Після 8 тиж культивування in vitro регенерована тканина містила до 50% сухої речовини (4% клітинної маси, 15% глікозаміногліканів і 31% колагенів). У ППЛК клітини мали веретеноподібну форму, невелику кількість глікозаміногліканів і колагену. У ВПГК ріст клітин був в 2 рази більш інтенсивним, ніж у ППЛК (Freed L. et al., 1993a). В умовах in vivo хондроцити, вирощені у ВПГК і ППЛК, протягом 1–6 міс виробляли тканину, гістологічно подібну до хряща. Імплантати містили глікозаміноглікани, колагени I і II типу (Freed L. et al., 1993a).

Фетальні хондроцити бика культивували в порозному високої щільності гідрофобному і гідрофільному поліетилені. Після 7 днів інкубації в обох субстратах клітини зберігали сферичну форму, містили в основному колаген II типу. Після 21 дня культивації виявилося, що гідрофільний матрикс містить більшу кількість колагену II типу, ніж гідрофобний (Livecchi A. et al., 1994).

Хрящову тканину також можна одержати шляхом культивування в моношарі на фільтрах Millicell-CM. Попереднє покриття фільтрів колагеном необхідно для прикріплення хондроцитів. Гістологічне дослідження культури демонструє акумуляцію хондроцитів у ВКМ, що містить протеоглікани і колаген II типу. Колаген I типу в такій культурі не виявлений. Хондроцити в отриманій хрящовій тканині мають сферичну форму, однак на поверхні тканини вони дещо сплощені. Товщина знову утвореної тканини збільшувалася з часом і залежала від початкової щільності моношару клітин. В оптимальних умовах культивування товщина хрящової тканини досягала 110 мкм, організація її клітин і колагену в поверхневий і глибокий шари аналогічна такій у суглобового хряща. ПКМ містить приблизно в 3 рази більшу кількість колагену і протеогліканів. Після 2 тиж культивації відзначена акумуляція матрикса, що дозволяла витягти тканину з фільтра і використовувати її для трансплантації (Boyle J. et al., 1995; Kandel R. et al., 1995).

C. Sims та співавтори (1996) досліджували культивування хондроцитів у поліетиленоксид-гелі — інкапсульованому полімерному матриксі, що дозволяє переносити велику кількість клітин шляхом ін’єкції. Через 6 тиж після ін’єкції в підшкірну клітковину у безтимусних мишей був утворений новий хрящ, який морфологічно характеризувався білим опалесціюванням подібно до гіалінового хряща. Дані гістологічного і біохімічного досліджень свідчили про наявність активно проліферуючих хондроцитів, що виробляють ПКМ.

Експлантація. Експлантація хрящової тканини використовується для дослідження процесів ана- і катаболізму в ній, підтримки гомеостазу, резорбції та репарації (Campbell M. et al., 1985; Sandy J. et al., 1991). Хондроцити в експлантатах хрящової тканини підтримують нормальний фенотип і склад ПКМ, схожі на такі в суглобовому хрящі in vivo. Після 5 днів культивування в присутності сироватки досягається постійний рівень процесів синтезу й природньої деградації (Campbell M. et al., 1984). Резорбцію тканини можна прискорити в основній культурі та культурі з додаванням сироватки за допомогою ряду агентів, наприклад, ІЛ-1β, ФНП-α, бактеріальних ліпополісахаридів, дериватів ретиноївої кислоти або активних кисневих радикалів. Для вивчення репарації хряща його ушкодження індукують розчинними медіаторами запалення (Н₂О₂, ІЛ-1, ФНП-α) або фізичним розривом матрикса.

Метод органотипових культур — модель для дослідження in vitro ефектів ізольованих зовнішніх факторів на хондроцити і навколишній їх матрикс. В умовах in vivo хондроцити розташовані у ПКМ рідко і не контактують один з одним. Культура експлантата суглобового хряща зберігає цю структурну організацію, а також особливі взаємодії між хондроцитами і навколишнім позаклітинним середовищем. Таку модель також використовують для вивчення впливу механічного стресу, фармакологічних агентів, факторів росту, цитокінів, гормонів на метаболізм хряща.

Ще однією перевагою експлантації хрящової тканини є відсутність ушкодження хондроцитів під дією протеолітичних ферментів або механічного фактора, що є неминучим при ізоляції клітин. Рецептори та інші мембранні білки і глікопротеїни захищені від пошкоджувальних факторів.

Культура хондронів. Хондрон — структурна, функціональна і метаболічна одиниця суглобового хряща, що складається з хондроциту, його перицелюлярного матриксу та компактної філаментної капсули і відповідає за гомеостаз матрикса. Хондрони механічним шляхом екстрагують із хряща і збирають за допомогою декількох послідовних низькошвидкісних гомогенізацій. Ізольовані із зон різної глибини хряща хондрони можна розподілити на чотири категорії: одиничний хондрон, спарені хондрони, множинні (3 або більше) лінійно розташовані хондрони (стовпчики хондронів), скупчення хондронів.

Одиничні хондрони зазвичай виявляють у середніх шарах інтактного хряща, спарені — на границі середніх і глибоких шарів, лінійно розташовані множинні хондрони типові для глибоких шарів інтактного хряща. Нарешті, скупчення хондронів складаються з випадково організованих груп одиничних і спарених хондронів, які зберігають агрегований стан після гомогенізації. Скупчення хондронів становлять великі фрагменти хряща, що зазвичай містять декілька хондронів і радіально розташовані колагенові фібрили, тобто типова організація, характерна для глибоких шарів матрикса (Poole C.A. et al., 1988). Хондрони імобілізують у прозорій агарозі, що дозволяє проводити дослідження їх структури, молекулярного складу та метаболічної активності. Систему хондрон — агароза розглядають як мікромодель хряща, яка відрізняється від традиційної системи хондроцит — агароза тим, що зберігається природне мікрооточення, немає необхідності здійснювати його синтез і складання (Poole C., 1997). Культура хондронів — модель для вивчення взаємодій клітин і матрикса в суглобовому хрящі в нормі й при патологічних станах.

Культура безсмертних хондроцитів. Для створення перманентних ліній клітин використовують рекомбінантну ДНК або онкогенвмісні віруси, здатні зробити клітину «безсмертною» (Horton W. et al., 1988; Thenet S. et al., 1992; Oxford J. et al., 1994; Mallein-Gerin F. et al., 1995). Безсмертні хондроцити мають здатність до нескінченної проліферації, зберігаючи стабільний фенотип. F. Mallein-Gerin та співавтори (1995) показали, що SV40T-онкоген індукує проліферацію хондроцитів миші, які при цьому продовжують стабільно експресувати колагени II, IX і XI типу, а також суглобовий агрекан і сполучний білок. Проте така лінія клітин набуває здатності синтезувати колаген I типу при культивуванні її в моношаровій культурі або в агарозному гелі.

W. Horton та співавтори (1988) описали лінію безсмертних клітин із низьким рівнем експресії мРНК колагену ІІ типу. Ці клітини були одержані шляхом їх трансформації ретровірусом миші, що містять v-myc- і v-raf-онкогени. Цей тип клітин становить унікальну модель для вивчення взаємодій суглобового матрикса під час відсутності колагену ІІ типу, а також регуляцію синтезу колагену ІІ типу (Oxford J. et al., 1994).

Культура хондроцитів із мутованими або вилученими генами — зручна модель для дослідження їх фізіологічної функції. Ця модель особливо підходить для вивчення ролі специфічних молекул в організації хрящового матриксу або дослідження ефектів різних регуляторних факторів на метаболізм хряща. Хондроцити з вилученим геном колагену IX типу синтезують колагенові фібрили більш широкі, ніж нормальні, що свідчить про те, що колаген IX типу регулює діаметр фібрил (Mallein-Gerin F. et al., 1995). Як відзначалося у главі 1, нещодавно виявлена мутація гена COL2A1, що кодує колаген ІІ типу в родинах із первинним генералізованим ОА. Для дослідження впливу мутантного колагену ІІ типу на суглобовий матрикс R. Dharmrvaram та співавтори (1997) виконали трансфекцію («зараження» чужою нуклеїновою кислотою) дефектного COL2A1 (аргінін у положенні 519 замінений на цистеїн) у фетальні хондроцити людини in vitro.

Система кокультур. У суглобі хрящ взаємодіє із клітинами інших типів, що утримуються в синовіальній мембрані, синовіальній рідині, зв’язках, субхондральній кістці. На метаболізм хондроцитів можуть впливати різні розчинні фактори, синтезовані зазначеними клітинами. Так, при артриті суглобовий хрящ руйнується протеолітичними ферментами і вільними радикалами, які продукуються синовіальними клітинами. Тому було розроблено моделі для вивчення складних взаємодій між хрящем і прилеглими тканинами, які одержали назву кокультури.

S. Lacombe-Gleise та співавтори (1995) культивували хондроцити кролика і остеобласти в системі кокультур (COSTAR), у якій клітини були відділені мікропористою мембраною (0,4 мкм), що дозволяла обмін між клітинами двох типів без будь-яких прямих контактів. Це дослідження продемонструвало здатність остеобластів стимулювати ріст хондроцитів за допомогою розчинних медіаторів.

A.M. Malfait та співавтори (1994) досліджували взаємодію моноцитів периферичної крові і хондроцитів. Ця модель зручна для вивчення процесів, опосередкованих цитокінами, при запальних артропатіях (РА, серонегативний спондилоартрит тощо). Автори моделі розділяли клітини протеїнзв’язувальною мембраною з порами діаметром 0,4 мкм. Дослідження показало, що стимульовані ліпополісахаридом моноцити виробляли ІЛ-1 і ФНП-α, які пригнічували синтез агрекану хондроцитами і сприяли деградації вже синтезованих агрегатів агрекану.

K. Tada та співавтори (1994) створили модель кокультури, в якій ендотеліальні клітини в колагеновому (І типу) гелі були розміщені у внутрішній камері, що була відділена від зовнішньої камери з розміщеними в ній хондроцитами фільтром із розміром пор 0,4 мкм. У стані повної ізоляції від зовнішньої камери ендотеліальні клітини людини утворювали трубки в колагеновому гелі у присутності ЕФР або ТФР-α. При одночасному культивуванні обох типів клітин ТФР-α залежне утворення трубок ендотеліальними клітинами пригнічувалося. Пригнічення хондроцитами цього процесу частково усувалося анти-ТФР-β-антитілами. Можна припустити, що ТФР-β, що виробляється хондроцитами, пригнічує васкуляризацію самого хряща.

C. Groot та співавтори (1994) одночасно культивували хондроцити із гіпертрофічної та проліферативної зон кістки 16-денного плода миші зі шматочками мозкової тканини. Після 4 днів культивування спостерігали трансдиференціювання хондроцитів в остеобласти і початок формування остеоїда. Через 11 днів культивування частина хряща була заміщена кістковою тканиною і кістковий матрикс був частково кальцифікований. Деякі нейропептиди і нейротрансмітери, що виробляються тканиною головного мозку, впливають на метаболізм остеобластів або мають рецептори на них. Серед них можна виділити норепінефрин (Kumagai H. et al., 1989), вазоактивний інтестинальний пептид (Bjurholm A. et al., 1988a; b), пептид, пов’язаний із геном кальцитоніну (Michelangeli V. et al., 1989; Bjurholm A. et al., 1990), субстанцію Р (Bjurholm A. et al., 1990) і соматостатин (Mackie E. et al., 1990). Культивовані разом із хондроцитами шматочки тканини головного мозку можуть продукувати деякі із наведених факторів, здатних індукувати процес трансдиференціювання хондроцитів в остеобласти.

ВПЛИВ ЗОВНІШНІХ ФАКТОРІВ НА КУЛЬТУРУ ХОНДРОЦИТІВ

Вплив напруги кисню на метаболізм хондроцитів. У більшості випадків культури хондроцитів розвиваються в умовах атмосферної напруги кисню. Проте добре відомо, що in vivo хондроцити існують в умовах гіпоксії і напруга кисню варіює при різних патологічних станах. Під час процесу дозрівання спостерігають значні зміни кровопостачання епіфізів. Внаслідок того, що васкуляризація варіює в різних зонах пластинки росту, варіює також у них і напруга кисню. C. Brighton і R. Heppenstall (1971) продемонстрували, що в пластинці великогомілкової кістки кроликів напруга кисню в гіпертрофічній зоні менша, ніж у хрящі, що її оточує. Виміри деяких параметрів метаболізму показали, що хондроцити здатні швидко реагувати на локальні зміни концентрації кисню. Насамперед, при низькій напрузі кисню знижується його споживання хондроцитами (Haselgrove J. et al., 1993). При зниженні напруги кисню від 21 до 0,04% збільшується утилізація глюкози, підвищуються активність ферментів гліколізу і синтез молочної кислоти. Навіть при низькій напрузі кисню абсолютна кількість АТФ, АДФ і АМФ залишається стабільною (Rajpurohit R. et al., 1996). Ці дані свідчать про спрямованість метаболізму хондроцитів на максимальне заощадження енергії. Проте синтетична активність, а отже, і процеси репарації змінюються в умовах гіпоксії (Lane J. et al., 1977).

Висока напруга кисню також впливає на метаболізм хондроцитів, викликаючи зменшення синтезу протеогліканів і ДНК (Lane J. et al., 1977), деградацію матрикса хряща (Sledge C., Dinle J., 1965). Ці ефекти, як правило, супроводжуються продукцією вільних кисневих радикалів (Henrotin Y. et al., 1993; Dascalu A. et al., 1996).

Вплив концентрації іонів і осмотичного тиску навколишнього середовища на функцію хондроцитів. У нативному хрящі концентрація іонів значно відрізняється від такої в інших тканинах: вміст натрію в позаклітинному середовищі становить 250–350 ммоль/л, а її осмолярність — 350–450 мосмоль/л. При ізолюванні хондроцитів із ПКМ та інкубації їх у стандартних середовищах (DMEM (Dulbecco’s Minimal Essential Medium — мінімальне есенційне середовище Дульбекко) осмолярність — 250–280,7 мосмоль/л) різко змінюється середовище навколо клітини. Крім того, концентрація кальцію та калію у стандартних середовищах значно нижча, ніж у нативній тканині, а концентрація аніонів — значно вища.

Додавання в середовище сахарози призводить до підвищення її осмолярності та індукує минуще внутрішньоклітинне підвищення концентрації Н+ і аніонів кальцію в цитозолі (Dascalu A. et al., 1996). Подібні внутрішньоклітинні зміни можуть впливати на процеси диференціювання хондроцитів та їх метаболічну активність. J. Urban та співавтори (1993) виявили, що включення ³⁵S-cльфату і ³Н-проліну ізольованими хондроцитами, що інкубуються в стандартному середовищі DMEM протягом 2–4 год, становило лише 10% від такого в нативній тканині. Інтенсивність синтезу досягла максимуму при осмолярності позаклітинного середовища 350–400 мосмоль/л як у тільки ізольованих хондроцитах, так і в експлантатах хрящової тканини. Більше того, об’єм хондроцитів збільшився на 30–40% після розташування ізольованих клітин у стандартне середовище DMEM зазначеної осмолярності. Проте при культивуванні хондроцитів в умовах нефізіологічної осмолярності протягом 12–16 год клітини адаптуються до нових умов, зменшуючи інтенсивність біосинтезу пропорційно зміні осмолярності позаклітинного середовища.

P. Borgetti та співавтори (1995) досліджували вплив осмолярності позаклітинного середовища на ріст, морфологію та біосинтез хондроцитів свині. Автори продемонстрували схожі біохімічні й морфологічні особливості хондроцитів, що культивувались у середовищах із осмолярністью 0,28 і 0,38 мосмоль/л. При осмолярності середовища 0,48 мосмоль/л протягом перших 4–6 год культивування спостерігали зниження проліферації клітин і синтезу білків, однак надалі відбувалося відновлення цих параметрів, які зрештою досягали контрольних величин. При культивуванні хондроцитів у середовищі з осмолярністю 0,58 мосмоль/л клітини втрачають здатність підтримувати фізіологічну інтенсивність проліферативних процесів і через 6 днів значно зменшується кількість хондроцитів. При осмолярності середовища 0,58 мосмоль/л спостерігають глибоке пригнічення синтезу білків. Крім того, при культивуванні в середовищах з осмолярністью 0,28–0,38 мосмоль/л хондроцити зберігають фізіологічний фенотип, при більш високій осмолярності (0,48–0,58 мосмоль/л) відбуваються значні зміни морфології клітин, що проявляється втратою характерного фенотипу, перетворенням хондроцитів у фібробластоподібні клітини, а також втратою клітинами здатності до складання матриксних протеогліканів. Результати цього дослідження свідчать про здатність хондроцитів реагувати на обмежені коливання осмолярності позаклітинного середовища.

Зміна концентрації інших іонів також може впливати на процеси біосинтезу в хондроцитах. Так, ступінь включення 35S (сульфату) підвищується на половину при підвищенні концентрації іонів калію від 5 ммоль/л (концентрація в стандартному середовищі DMEM) до 10 ммоль/л (концентрація у ПКМ in vivo) (Urban J. et al., 1993). Концентрація кальцію нижче 0,5 ммоль/л сприяла продукції колагену зрілими хондроцитами бика, тоді як концентрація 1–2 ммоль/л (відповідає концентрації в стандартному середовищі DMEM) викликала значне зниження синтезу колагену. Помірне збільшення біосинтезу спостерігали при високих рівнях кальцію (2–10 ммоль/л) (Koyano Y. et al., 1996). У прикріпленні хондроцитів до білків ПКМ беруть участь різні катіони. Так, іони магнію і марганцю забезпечують прикріплення до фібронектину і колагену ІІ типу, тоді як іони кальцію не беруть участі у прикріпленні хондроцитів до білків (Loeser R., 1994). Таким чином, результати описаних досліджень свідчать про вплив змін позаклітинних іонів калію, натрію, кальцію і осмолярності середовища на біосинтетичну функцію хондроцитів, інкубованих у стандартних середовищах.

Вплив механічного стресу на метаболізм хондроцитів. Іммобілізація суглоба викликає оборотну атрофію хряща, що свідчить про необхідність механічних стимулів для нормального перебігу метаболічних процесів у ПКМ. У більшості випадків моделі культур клітин, що використовуються, існують в умовах нормального атмосферного тиску. M. Wright та співавтори (1996) показали, що механічне оточення впливає на метаболізм хондроцитів, реакція клітин залежить від інтенсивності й частоти компресійного навантаження. Експерименти з навантаженням на експлантати інтактного суглобового хряща in vitro продемонстрували зниження синтезу білків і протеогліканів під дією статичного навантаження, тоді як динамічне навантаження стимулює ці процеси (Saamanen A. et al., 1990; Korver T. et al., 1992; Parkkinen J. et al., 1992). Точні механізми реалізації впливу механічного навантаження на хрящ складні й, імовірно, пов’язані з деформацією клітин (Lee D., Bader D., 1995), гідростатичним тиском (Parkkinen J. et al., 1993), осмотичним тиском (Urban J. et al., 1993), електричним потенціалом (Frank E., Grodzinsky A., 1987) і поверхневими клітинними рецепторами до молекул матрикса (Holmvall K. et al., 1995). Для вивчення впливу кожного із зазначених параметрів необхідно створити систему, у якій можна незалежно змінювати один із параметрів. Наприклад, культура експлантата не підходить для дослідження деформації клітин, однак її можна використовувати для вивчення загального впливу тиску на метаболічну активність хондроцитів. Компресія хряща призводить до деформації клітин, а також супроводжується виникненням градієнта гідростатичного тиску, електричного потенціалу, потоку рідини та зміною таких фізико-хімічних показників, як вміст води в матриксі, щільність електричного заряду, рівень осмотичного тиску. Деформацію клітин можна вивчити за допомогою ізольованих хондроцитів, занурених в агарозний або колагеновий гель (Lee D., Bader D., 1995).

З метою дослідження впливу механічної стимуляції на культуру хондроцитів розроблено кілька систем. Деякі дослідники використовують для цього системи, у яких тиск прикладається до культури клітин через газоподібну фазу. Так, J.-P. Veldhuijzen та співавтори (1979), використовуючи тиск вище атмосферного на 13 кПа з низькою частотою (0,3 Гц) протягом 15 хв, спостерігали підвищення синтезу цАМФ і протеогліканів і зниження синтезу ДНК. R. Smith та співавтори (1996) показали, що переміжна експозиція культури первинних хондроцитів бика гідростатичном тиском (10 МПа) з частотою 1 Гц протягом 4 год викликала підвищення синтезу агрекану і колагену ІІ типу, тоді як постійний тиск не впливав на ці процеси. Використовуючи аналогічну систему, M. Wright та співавтори (1996) повідомили, що циклічний тиск на культуру клітин асоціюється з гіперполяризацією клітинної мембрани хондроцитів і активацією Са²⁺-залежних калієвих каналів. Таким чином, ефекти циклічного тиску опосередковуються активованим розтяганням іонних каналів у мембрані хондроцитів. Відповідь хондроцитів на гідростатичний тиск залежить від умов культивування клітин і частоти прикладеного навантаження. Так, циклічний гідростатичний тиск (5 МПа) знижує включення сульфату в моношар хондроцитів при частоті 0,05; 0,25 і 0,5 Гц, тоді як при частоті більше 0,5 Гц включення сульфату в експлантат хряща підвищується (Parkkinen J. et al., 1993).

M. Bushmann та співавтори (1992) повідомили, що хондроцити в агарозному гелі змінюють біосинтез у відповідь на статичне і динамічне механічне навантаження так само, як і культивований інтактний орган. Автори виявили, що механічне навантаження генерує гіперосмотичний стимул з подальшим зниженням рН у хондроцитах.

Ефект механічного розтягання можна досліджувати на культурі клітин, занурених у гель. Силу розтягання можна створити за допомогою контрольованого комп’ютером вакууму. Коли система перебуває у вакуумі певного ступеня, дно чашки Петрі з культурою клітин подовжується на відому величину, деформація максимальна з країв дна чашки і мінімальна в центрі. Розтягання передається і культивованим у чашці Петрі хондроцитам. За допомогою цього методу K. Holmvall та співавтори (1995) показали, що в культивованих у колагеновому (II тип) гелі клітинах хондросаркоми збільшена експресія мРНК α₂-інтегрину. α₂β₁-інтегрин здатний зв’язуватися з колагеном II типу. Його розглядають як механорецептор, оскільки він взаємодіє з актинзв’язувальними протеїнами, таким чином з’єднуючи ПКМ і цитоскелет.

Вплив рН на метаболізм хондроцитів. рН інтерстиціальної рідини ПКМ хрящової тканини більш кислий, ніж в інших тканинах. A. Maroudas (1980) визначив рН матрикса суглобового хряща на рівні 6,9. B. Diamant та співавтори (1966) виявили рН 5,5 у патологічних умовах. Відомо, що хондроцити живуть при низькому РО₂, що свідчить про найбільш важливу роль гліколізу (95% всього метаболізму глюкози) у метаболізмі цих клітин; гліколіз супроводжується продукцією великої кількості молочної кислоти (Stefanovic-Racic M. et al., 1994).

Крім закислення середовища продуктами гліколізу важливе значення мають самі компоненти матрикса. Велика кількість фіксованого негативного заряду на протеогліканах модифікує позаклітинний іонний склад: відзначаються висока концентрація вільних катіонів (наприклад, Н+, Nа+, К+) і низька концентрація аніонів (наприклад Cl^–, НСО₃^–) (Lesperance L. et al., 1992). Крім того, під дією механічного навантаження відбувається вигнання води із ПКМ, що призводить до підвищення концентрації фіксованих негативних зарядів і залучення великої кількості катіонів у матрикс. Це супроводжується зниженням рН позаклітинного середовища, яке впливає на внутрішньоклітинне рН, модифікуючи тим самим метаболізм хондроцитів. R. Wilkin та A. Hall (1995) вивчали вплив рН позаклітинного та внутрішньоклітинного середовища на біосинтез матрикса ізольованими хондроцитами бика. Вони спостерігали подвійну модифікацію синтезу матрикса при зниженні рН. Невелике зниження цього показника (7,4<pН<7,1) на 50% збільшувало включення ³⁵SO₄ і ³Н-проліну в хондроцити, тоді як більш глибоке закислення середовища (рН<7,1) пригнічувало синтез на 75% порівняно з контролем. Створення ж низького рН (6,65) за допомогою іонів амонію викликало зниження синтезу матрикса тільки на 20%. Одержані результати свідчать про те, що модифікацію рН позаклітинного середовища синтезу матрикса не можна пояснити тільки змінами рН внутрішньоклітинного середовища. Крім того, хондроцити мають здатність регулювати внутрішньоклітинну рН за допомогою Nа+, Н+-обмінника, Nа+-залежного Cl^–—НСО₃^–-транспортеру і Н+/АТФази (Dascalu A. et al., 1993).

Вплив складу середовища для культивування на метаболізм хондроцитів. Середовище для культивування хондроцитів має відповідати умовам експерименту. В останні роки для оптимізації умов культивування використовують телячу сироватку. Однак при використанні сироватки необхідно враховувати ряд важливих моментів:

• зовнішній ріст клітин від периферії тканини в культурах органа;
• варіабельність складу сироваток різних серій (Morales T., 1991a);
• наявність у них невідомих компонентів;
• підвищений ризик виникнення перешкод, артефактів при дослідженні впливу різних біологічних факторів на метаболічну активність клітин.

Прикладом останнього може бути дослідження (Ribault D. et al., 1997) впливу ЕФР на хондроцити хряща у щурів. ЕФР стимулював включення 3Н-німідину та підвищення вмісту ДНК у культурі. Цей ефект був більш виражений при низьких концентраціях сироватки (≤1%), однак при високій концентрації (≥7,5%) ефект зникав.

Добре відомо, що рівні синтезу і деградації в DMEM, збагаченою телячою сироваткою, значно підвищені порівняно з умовами in vivo. Відмінності між метаболізмом in vivo та in vitro можуть бути викликані відмінностями між синовіальною рідиною й середовищем, у якому культивуються клітини. D. Lee та співавтори (1997) культивували хондроцити молодих биків в агарозі з використанням поживного середовища, що містить DMEM, збагаченого 20% телячою сироваткою і великою кількістю нормальної алогенної синовіальної рідини. Наявність синовіальної рідини в середовищі індукувало збільшення кількості протеогліканів до 80% загальної кількості синовіальної рідини. Одержані результати свідчать про те, що синовіальна рідина в культурі індукує рівень метаболізму, аналогічний такому in vivo, з високим рівнем синтезу глікозаміногліканів і низьким рівнем розподілу клітин.

G. Verbruggen та співавтори (1995) показали, що синтез ³⁵S-агрекану хондроцитами людини, культивованими в агарозі в DMEM без сироватки, становив 20–30% рівня синтезу, що спостерігався в DMEM, збагаченій 10% телячою сироваткою. Автори визначили ступінь, при якому ІФР-1, ІФР-2, ТФР-β або інсулін відновлюють продукцію агрекану в середовищі без сироватки. Автори зробили висновок, що 100 нг/мл інсуліну, ІФР-1 або ІФР-2 частково відновлюють синтез агрекану до 39–53% контрольного рівня. При комбінації зазначених факторів явищ синергізму або кумуляції не виявлено. Водночас 10 нг/мл ТФР-β при наявності 100 нг/мл інсуліну стимулювали синтез агрекану до 90% і більше від референтного рівня. І нарешті, трансферин сироватки людини, один або в комбінації з інсуліном, не впливав на синтез агрекану. При заміні телячої сироватки бичачим сироватковим альбуміном вміст агрегатів агрекану значно знизився. Збагачення середовища для культивування інсуліном, ІФР або ТФР-β частково відновлювало здатність клітин продукувати агрегати агрекану. При цьому ІФР-1 та інсулін здатні підтримувати гомеостаз в культурах клітин. Після 40 днів культивування в середовищі, збагаченому 10–20 нг/мл ІФР-1, синтез протеогліканів підтримувався на тому ж рівні або навіть на більш високому порівняно із середовищем, що містить 20% телячої сироватки. Катаболічні процеси мали більш повільний перебіг в середовищі, збагаченому ІФР-1, ніж в середовищі, збагаченому 0,1% розчином альбуміну, але дещо швидше в середовищі, збагаченому 20% сироваткою. У культурах клітин, що живуть тривало, 20 нг/мл ІФР-1 підтримує стабільний стан клітин (Campbell M. et al., 1984).

D. Lee та співавтори (1993) порівняли вплив складу середовища для культивування (DMEM, DMEM + 20% теляча сироватка, DMEM + 20 нг/мл ІФР-1) на синтез ДНК в культурі експлантата хрящової тканини, багатошаровій культурі та суспензії в агарозі. При культивуванні в агарозі в присутності сироватки автори спостерігали тенденцію до гуртування хондроцитів у великі скупчення. Клітини, що культивувалися без сироватки або з ІФР-1, зберігали в агарозі круглу форму, збиралися в невеликі групи, але не формували великі агрегати. У моношарі синтез ДНК був значно вищим у середовищі, що містить сироватку, ніж в середовищі, збагаченому ІФР-1; синтез ДНК в останньому був значно вищим, ніж у незбагаченому середовищі. При культивуванні хондроцитів у суспензії в агарозі в незбагаченому середовищі та в середовищі з ІФР-1 не виявлено відмінностей у синтезі ДНК. Водночас культивування суспензії хондроцитів в агарозі в середовищі, збагаченому сироваткою, супроводжувалося підвищеним включенням радіонуклеотиду 3Н-німідину порівняно з іншими середовищами.

Вітамін С необхідний для активації ферментів, що беруть участь у формуванні стабільної спіральної структури колагенових фібрил. Хондроцити у разі дефіциту аскорбінової кислоти синтезують недогідроксильовані неспіральні попередники колагену, які повільно секретуються. Введення аскорбінової кислоти (50 мкг/мл) викликає гідроксилювання колагенів II і IX типу та їх секрцію в нормальній кількості. Додавання вітаміну С не впливало на рівень синтезу протеогліканів. Отже, секреція колагену регулюється незалежно від секреції протеогліканів (Pacifici M., 1990).

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ МОДЕЛЮВАННЯ ОА У ТВАРИН

K.P.H. Pritzker (1994) визначив експериментальну модель будь-якої хвороби у тварин як «гомогенну групу тварин, у яких є успадкований, природно надбаний або експериментально індукований біологічний процес, що зазнає наукового дослідження, який за одним або декількома параметрам схожий із хворобою у людини». Моделі ОА у тварин зручні для дослідження еволюції структурних змін у суглобових тканинах із метою з’ясування того, як різні фактори ризику їх ініціюють або сприяють появі цих змін, а також для оцінки застосовуваних терапевтичних заходів. Необхідно пам’ятати, що ОА — це захворювання не однієї тканини — суглобового хряща, а всіх тканин ураженого суглоба, включаючи субхондральну кістку, синовіальну оболонку, меніски, зв’язки, періартикулярні м’язи й аферентні нерви, закінчення яких лежать як ззовні, так і всередині суглобової капсули. Проведені дослідження фармакологічних агентів на моделях у тварин фокусуються головним чином на їх впливі на суглобовий хрящ. На експериментальних моделях неможливо оцінити основний симптом ОА в людини — біль у суглобах. Водночас при моделюванні ОА у тварин не враховують ряду важливих факторів, що сприяють розвитку та прогресуванню ОА (наприклад вертикальне положення тіла людини, слабкість періартикулярних м’язів тощо).

Неповний, але досить значний перелік моделей ОА наведено у табл. 4.1. Очевидно, що найбільш наочною моделлю хвороби є та, яка має найбільшу подібність зі змінами при ОА у людини. Найбільший інтерес моделі ОА у тварин становлять при дослідженні ефективності препаратів, модифікуючих хворобу (DMOAD — disease modifying OA drugs). Незважаючи на те що ряд препаратів цієї групи запобігає розвитку або сповільнює прогресування експериментально-індукованого чи спонтанного ОА у тварин, всі вони виявилися неефективними при вивченні їх дії у людини (Brandt K.D., 1999).

Таблиця 4.1

Моделі ОА у тварин (за: Doherty N.S. et al., 1998, зі змінами)

*в/с — внутрішньосуглобово.

Досі дуже популярні фізично і хімічно індуковані моделі ОА, проте вони швидше відображають процеси, які спостерігаються при вторинному ОА у людини, ніж при ідіопатичному. Альтернативою їм є моделі спонтанного ОА у двоногих приматів і чотириногих тварин.

Деякі автори досить скептично ставляться до моделювання ОА у тварин взагалі. Так, на думку M.E.J. Billingham (1998), використання моделей для відкриття модифікуючих ОА препаратів, є «…дорогою авантюрою».

МОДЕЛІ СПОНТАННОГО ОА

Практично у всіх інбридних ліній мишей розвивається ОА різного ступеня тяжкості й локалізації. Найвищу захворюваність на ОА та найбільш тяжкий перебіг хвороби спостерігають у мишей ліній STR/ORT і STR/INS (Sokoloff L., 1956). Серед мишей лінії STR/ORT захворювання більш поширене, воно має тяжчий перебіг у самців, ніж у самок. Первинне ушкодження суглобового хряща розвивається в медіальній частині пластинки великогомілкової кістки. Передбачалося, що появі змін у хрящі передує зміщення надколінка, однак R.G. Evans та співавтори (1994), C. Collins та співавтори (1994) виявили, що у всіх мишей цієї лінії ушкодження хряща розвивається до 11 міс, проте не в усіх виявлено зміщення надколінка. Ці ж автори виявили, що змінам у суглобовому хрящі у мишей ліній STR/ORT часто передує хондроцитарно-остеобластна метаплазія клітин сухожиль і зв’язок навколо уражених колінних суглобів, що вказує на первинність цих змін у патогенезі ОА в цій моделі. Можливо, що первинна кальцифікація зв’язок і сухожиль змінює механічний тиск на внутрішньосуглобові структури й подальші зміни в суглобовому хрящі відображають спробу підтримати нормальне навантаження на суглоб. На відміну від моделей із використанням морських свинок і макак, у яких дегенерації хряща передують зміни в субхондральній кістці, у мишей ліній STR/ORT і STR/INS субхондральний склероз з’являється пізніше.

Перевагою цієї моделі ОА є невеликий розмір тварин, що потребує мінімальної витрати фармакологічного агента, що випробовується. Однак розмір також є й недоліком, оскільки у мишей утруднений біохімічний, патогістологічний аналіз хряща.

Дослідження A.M. Bendele і J.F. Hulman (1988), A.M. Bendel та співавторів (1989), а також S.C.R. Meacock та співавторів (1990) присвячені вивченню природного перебігу спонтанного ОА у морських свинок, активізували інтерес до цієї моделі хвороби. Починаючи з 13-місячного віку у всіх самців морських свинок лінії Dunkin Hurtley з’являється дегенерація суглобового хряща. Аналогічні зміни у самок з’являються трохи пізніше і носять більш м’який характер. У тварин віком 1 рік спостерігають повну втрату суглобового хряща в ділянці медіального виростка стегнової кістки і пластинки великогомілкової кістки. Збільшення маси тіла морських свинок лінії Dunkin Hurtley погіршує перебіг хвороби, а зменшення маси тіла до 900 г і менше поліпшує перебіг ОА (Bendele A.M., Hulman J.F., 1991). У цієї моделі віком 8 тиж вже виявляють зміни субхондральної кістки, тобто останні передують ураженню хряща (Watson P.J. et al., 1994). Зміни хрестоподібних зв’язок колінних суглобів можуть прискорювати ремоделювання кісткової тканини.

Спонтанний ОА розвивається у макак rhesus і cynomolgus (DeRousseau С.J., 1985; Kessler M.J. et al., 1986; Pritzker K.P.H. et al., 1989; Châteauvert J.M. et al., 1990; Moskowitz R.W., 1992; Carlson C.S. et al., 1995). Дуже важливою перевагою приматів перед іншими тваринами, що використовуються для створення експериментальної моделі ОА, є наявність двох ніг. Захворювання розвивається у осіб середнього/похилого віку. Ранніми гістологічними знахідками є потовщення субхондральної кістки з подальшим розволокненням суглобового хряща в ділянці медіальної пластинки великогомілкової кістки (Carlson C.S. et al., 1995). Надалі в процес втягується і латеральна пластинка. Слід відмітити, що дегенерація суглобового хряща починає розвиватися лише після того, як товщина субхондральної кістки досягне 400 мкм (Carlson C.S. et al., 1996). Ріст поширеності та ступеня тяжкості ОА у макак відбувається з віком, однак на ці показники не впливають стать і маса тіла. Досі моделі ОА у приматів не використовували для вивчення ефективності DMOADs.

Моделі фізично (хірургічно) індукованого ОА. Моделі ОА, засновані на хірургічно індукованій розхитаності колінних суглобів, що змінює механічний тиск на них, найбільш часто використовують у собак і кроликів. Найбільш широко застосовують модель із перетинанням хрестоподібних зв’язок у собак (Brandt K.D., 1994). При створенні хірургічних моделей ОА у кроликів використовують операції з перетинання хрестоподібних зв’язок із вирізуванням медіальних і колатеральних зв’язок або без нього, тотальну або парціальну меніскектомію, хірургічний розрив менісків (Moskowitz R.W., 1992). У морских свинок описані хірургічні моделі ОА, створені шляхом перетинання хрестоподібних і колатеральних зв’язок, часткової меніскектомії (Bendele A.M., White S.L., 1987; Meacock S.C.R. et al., 1990). Часткова меніскектомія у морських свинок веде до утворення остеофітів протягом 2 тиж і надлишкової дегенерації суглобового хряща протягом 6 тиж.

Донедавна до моделі ОА у собак, одержаній шляхом перетинання передніх хрестоподібних зв’язок, відносилися скептично у зв’язку з відсутністю ульцерації хряща та помітного прогресування хвороби, на відміну від того, як це спостерігається при ОА в людини. J.L. Marshall і S.-E. Olsson (1971) виявили, що зміни у тканинах колінних суглобів у собак через 2 роки після операції практично не відрізнялися від зареєстрованих відразу після неї. Автори припустили, що механічні фактори (наприклад фіброз суглобової капсули і утворення остеофітів) стабілізують розбовтаний після операції колінний суглоб і перешкоджають подальшому прогресуванню руйнування суглобового хряща. Також було запропоновано вважати цю модель моделлю ушкодження та репарації хряща, а не моделлю ОА. Однак результати досліджень, проведених K.D. Brandt та співавторами (1991), які більш тривало вивчали динаміку змін у тканинах колінних суглобів, дестабілізованих перетинанням передніх хрестоподібних зв’язок, спростували припущення попередніх авторів.

C.A. Mcdevitt та співавтори (1973; 1977) виявили, що вже протягом перших днів після перетинання хрестоподібних зв’язок збільшується синтез протеогліканів хондроцитами суглобового хряща. Протягом 64 тиж після хірургічного індукування нестабільності колінного суглоба товщина суглобового хряща була вище норми, хоча біохімічні, метаболічні й гістологічні зміни в ньому відповідали таким при ОА (Adams M.E., Brandt K.D., 1991). Це потовщення хряща асоціювалося з підвищеним синтезом протеогліканів та їх високою концентрацією в суглобовому хрящі. Використовуючи МРТ, M.E. Adams і K.D. Brandt (1991) показали, що після перетинання хрестоподібних зв’язок гіпертрофія хряща підтримується протягом 36 міс, надалі виникає прогресуюча втрата хряща, таким чином вже через 45 міс більша частина суглобових поверхонь позбавлена хряща. Морфологічне дослідження хряща через 54 міс після операції підтвердило результати МРТ. Таким чином, M.E. Adams і K.D. Brandt (1991) довели, що хірургічно індуковану нестабільність колінних суглобів у собак можна вважати моделлю ОА.

Феномен гіпертрофічної репарації суглобового хряща добре ілюструє вищенаведена модель ОА у собак. Проте відомо, що цей феномен властивий не лише цій моделі. Гіпертрофія суглобового хряща, яка носила репаративний характер, вперше була описана у хворих на ОА E.G.L. Bywaters (1937), а згодом L.C. Johnson. Її також виявляють і в інших моделях ОА — у кроликів після часткової меніскектомії (Vignon E. et al., 1983), у макак rhesus гіпертрофія хряща розвивається спонтанно (Chateauvert J. et al., 1989; 1990).

Сучасне трактування патогенезу ґрунтується в основному на прогресуючій втраті хряща, однак часто автори не враховують його потовщення і посилення синтезу протеогліканів, що відповідає гомеостатичній фазі стабілізованого ОА. Протягом цієї фази репарація хряща компенсує його втрату і може підтримувати суглоб у функціональному стані тривалий час. Але репаративна тканина в такому разі часто не може справлятися з діючим на неї механічним навантаженням так, як це робить здоровий суглобовий хрящ, що призводить до нездатності хондроцитів підтримувати нормальний склад матрикса та зниження синтезу протеогліканів. Розвивається кінцева стадія ОА (Brandt K.D. et al., 1991).

Вивчення артропатії Шарко призвело до появи методу нейрогенного прискорення моделювання хірургічно індукованого ОА. Артропатія Шарко характеризується тяжкою деструкцією суглобів, суглобовими «мишами», випотом у суглоб, нестабільністю зв’язок, утворенням нової кісткової та хрящової тканини у межах суглоба. Загальна концепція патогенезу артропатії Шарко (нейрогенної) полягає в перериванні чутливих сигналів від пропріорецепторів і ноціцепторів кінцівок у центральну нервову систему (ЦНС) (Brandt K.D., 1999). Для прискорення прогресування ОА, індукованого перетинанням передніх хрестоподібних зв’язок у собак, перед операцією виконують ганглійектомію (Vilensky J.A. et al., 1994) або вирізання нерва, що іннервує суглоб (O’connor B.L. et al., 1992), що приводить до появи ерозій хряща вже в 1-й тиждень після операції (O’connor B.L. et al., 1985). Відзначимо, що новий DMOAD діацереїн виявився ефективним при використанні на повільно прогресуючій (нейрологічно інтактній) моделі ОА, однак препарат виявився неефективним при нейрогенно прискореному експериментальному ОА (Brandt K.D. et al., 1997).

На закінчення слід відзначити, що неможливо повністю оцінити ідентичність експериментальної моделі ОА та ОА у людини, оскільки етіологія й точні механізми патогенезу захворювання досі не з’ясовані. Як зазначалося раніше, основним завданням вивчення експериментальних моделей ОА у тварин є їх використання для оцінки ефективності нових препаратів, головним чином групи модифікуючих хворобу. Ймовірність того, наскільки результати лікування тварини співпадуть із результатами застосування експериментального фармакологічного агента у людини, також неможливо визначити. N.S. Doherty та співавтори (1998) акцентували увагу на існуванні значних відмінностей між видами тварин, що використовуються для моделювання ОА, відносно різного розвитку у них цієї патології, різних медіаторів, рецепторів, ферментів, що призводить до необ’єктивної екстраполяції терапевтичної активності нових препаратів, що використовуються у тварин, на людину. Прикладом може бути висока ефективність НПЗП при моделюванні запального артриту у гризунів (Rogachevsky R.A. et al., 1994). Це призвело до переоцінки ефективності НПЗП у людини, у якої ПГ не відіграють тієї фундаментальної ролі в патогенезі захворювання, яку вони відіграють у гризунів, а клінічна ефективність НПЗП швидше обмежується лікуванням симптомів, ніж модифікацією хвороби.

Водночас недооцінка нових фармакологічних агентів при вивченні їх ефективності на моделях у тварин може привести до втрати потенційно ефективних у людини терапевтичних агентів. Наприклад, солі золота, пеніциламін, хлорохін і сульфасалазин, що мають певний ефект при терапії РА, абсолютно не ефективні у тварин, яких використовують для скринінгу антиревматичних препаратів (Zhang J. et al., 1995). Відкриття ефективності цих препаратів у хворих на РА було щасливою випадковістю, їх точні механізми дії до кінця не з’ясовані (Brandt K.D., 1999).

Різниця відповіді тварини з модельованим ОА і хворого на ОА на лікування DMOAD багато в чому залежить від колагенази — ферменту, який, як вважають, бере активну участь у патогенезі ОА. У гризунів із модельованим ОА часто виявляють інгібітори інтерстиціальної колагенази (колагеназ-1 або ММП-1) (Howell D.S. et al., 1986), проте гомолог колагенази-1 людини у гризунів не виявлений, можливо, його не існує. Таким чином, специфічні інгібітори колагенази-1 людини не виявлять терапевтичної ефективності у гризунів з експериментальним ОА. Більшість інгібіторів ММП, створених на сьогодні, неселективні й тому пригнічують колагеназу-3 (ММП-13), що бере участь у патогенезі експериментального ОА у гризунів. Більше того, як показали дослідження N.R.A. Beeley та співавторів (1994), J.M.P. Freije та співавторів (1994), колагеназа-3 людини експресується в суглобовому хрящі пацієнтів із ОА і, можливо, відіграє роль у патогенезі захворювання.

Можна припустити, що зазначені медіатори, рецептори або ферменти відіграють аналогічну роль у патогенезі модельованого ОА у певного виду тварини та в людини. Прикладом може служити хемотаксична здатність лейкотрієну В4, яка у людини, миші й кролика вважається однаковою, проте активність антагоністів цієї біологічно активної речовини між видами тварин має відмінності в 1000 разів (Doherty N.S. et al., 1998). Щоб уникнути подібних неточностей в експериментах, необхідно створити методи, що дозволяють досліджувати фармакодинаміку in vivo. Так, можна вивчати вплив будь-яких речовин на активність екзогенних ферментів або медіаторів людини. Ця методика була застосована V. Ganu та співавторами (1994) для оцінки активності інгібіторів ММП шляхом визначення здатності препаратів пригнічувати вивільнення протеогліканів із суглобового хряща після ін’єкції стромелезину людини в колінний суглоб кролика.

Незважаючи на те що результати, одержані в експерименті на модельованому ОА, можуть призвести до неправильної оцінки потенційних DMOAD, моделі ОА у тварин відіграють важливу роль у базисних дослідженнях. Остаточний висновок про ефективність фармакологічних агентів у терапії хвороб людини можна зробити лише після проведення ІІІ фази клінічних випробувань у людини.