Инновационные технологии для выявления антибиотикорезистентных бактерий

Устойчивые к лекарственным средствам патогены спровоцировали кризис резистентности к антибиотикам, который угрожает общественному здоровью, сельскому хозяйству, животноводству. Иногда резистентность возбудителя исследуют только после того, как один или несколько стандартных антибиотиков не оказывают клинического эффекта.

Измерение бактериального роста

Золотой стандарт для оценки чувствительности возбудителей к антибиотикам — дисковый диффузионный тест — появился в 1889 г. Бактерии культивируют на чашке с агаром, а затем помещают крошечные бумажные диски, пропитанные препаратами, на растущие клетки. Этот принцип определения чувствительности к антибиотикам автоматизирован в таких системах тестирования, как BD Phoenix от BD Biosciences VITEK 2 компании bioMérieux. Системы засевают бактерии в жидкие среды с антибиотиками и ищут оптические изменения, указывающие на рост или гибель бактерий.

В 2018 г. Евгений Иделевич (Evgeny Idelevich) разработал метод исследования, основанный на технологии MALDI – TOF. Это метод масс-спектрометрии, в основе которого — лазерно-индуцированная ионизация. Культуру патогена (например Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella pneumoniae) наносят непосредственно на твердую матрицу-носитель и инкубируют каждую каплю с различным антибактериальным препаратом. Затем обрабатывают образец с помощью системы, специально разработанной для идентификации бактерий: MALDI Biotyper от Bruker Daltonik. Интенсивность характерных спектральных пиков указывает на степень чувствительности культуры к антибиотику.

В 2013 г. Джованни Лонго (Giovanni Longo) из Национального исследовательского совета Италии (National Research Council of Italy) выявил, что при связывании патогенной Escherichia coli с микроструктурами, которые называются кантилеверами, и воздействии на нее антибиотиков кантилевер смещался вверх и вниз из-за небольших движений прикрепленных живых бактерий. Движения прекращались, если возбудитель был чувствителен к антибиотикам. Движение было видно под атомно-силовым микроскопом в течение нескольких минут — задолго до репликации бактерий.

Физик Камил Экинчи (Kamil Ekinci) из Бостонского университета (Boston University) предлагает использовать электрический ток. Принцип метода — преобразование роста бактерий в электрический сигнал. Образец мочи с примесью K. pneumoniae , частой причины инфекций мочевыводящих путей, помещают непосредственно в канал микрофлюидного устройства с антибиотиком и отслеживают электрическую проводимость через канал. При разрастании бактерии создают большее электрическое сопротивление. К недостаткам метода относится недостаточная точность в отношении медленно растущих патогенов, таких как M. tuberculosis.

Измерение молекулярных маркеров

Тесты, основанные на росте бактерий, просты, дешевы и неспецифичны: один тест работает с широким спектром патогенов. Но результаты тестов очень зависят от условий роста и правильной концентрации антибиотиков.

В качестве альтернативы Сюзанна Хойсслер (Susanne Häussler) и другие исследователи обращались к геномике. Выявление генов, которые явно связаны с механизмами устойчивости к антибиотикам, — идеальный путь к более быстрой диагностике, поскольку он не требует длительной бактериальной инкубации.

Гари Школьник (Gary Schoolnik) из Стэнфордского университета (Stanford University) разработал одноразовый диагностический тест Visby для локального использования. Методика фокусируется на мутациях, которые обусловливают устойчивость к ципрофлоксацину. Мутации в гене, кодирующем фермент гиразу А, определяют разницу между штаммами Neisseria gonorrhoeae, которые устойчивы или чувствительны к ципрофлоксацину. Методика Visby обходит технические ограничения, свойственные тестам, проведенным методом полимеразной цепной реакции, сводя анализ к простому изменению цвета. Амплифицированные фрагменты перетекают в камеру устройства, которая содержит зонды захвата для каждого варианта гена. Связывание приводит к изменению цвета, которое отражает чувствительность штамма.

Другие ученые продолжают исследовать полногеномное секвенирование, чтобы охватить все аллели, отвечающие за резистентность к антибиотикам. Сегодня методы, основанные исключительно на секвенировании генома, хорошо работают для некоторых патогенов, таких как Salmonella enterica, но мутации в нескольких регуляторных генах могут изменять паттерны экспрессии генов (и, следовательно, устойчивость) других, включая P. aeruginosa .

В 2014 г. Чикара Фурусава (Chikara Furusawa), биоинженер из RIKEN, изучил лабораторные штаммы E. coli, адаптирующиеся к росту при наличии различных антибиотиков, и установил, что он может использовать изменения в экспрессии генов для более точного прогнозирования устойчивости, чем с самими геномными последовательностями ДНК. Корреляция между экспрессией генов и устойчивостью значительно выше, чем корреляция между устойчивостью и геномными маркерами.

Прогнозирование будущей резистентности

В своей работе С. Хойсслер описывает сочетание геномных и транскриптомных маркеров как лучший критерий для прогнозирования устойчивости P. aeruginosa к антибиотикам с применением технологии машинного обучения. Вместо простого выявления мутаций, вызывающих устойчивость, используются алгоритмы для определения критериев вариаций ДНК и РНК, которые отвечают за антибиотикорезистентность штамма. Вместо того чтобы просто информировать врачей о текущем профиле резистентности патогена, эти алгоритмы могут также выявить, какие механизмы устойчивости к антибиотикам у штамма могут развиться в ответ на лечение.

М. Фархат применила метод машинного обучения, который использует полные последовательности генома для прогнозирования резистентности M. tuberculosis. Веб-инструмент под названием GenTB может прогнозировать устойчивость к нескольким противотуберкулезным препаратам: в то время как одна распространенная мутация отвечает за 80% устойчивости к препаратам первого ряда, используемым для лечения туберкулеза, несколько редких вариантов демонстрируют небольшое повышение устойчивости к препаратам второго ряда.

Работа в процессе

Какой бы подход они ни использовали, исследователи сталкиваются с одной и той же фундаментальной проблемой: нужно разработать диагностику, которая значительно улучшит характеристики существующих устройств.

Некоторые разрабатываемые тесты ограничены типами образцов, которые они могут обрабатывать, или бактериями либо антибиотиками, которые они могут тестировать. В настоящее время диагностика Visby ограничена, например, гонококковыми инфекциями, а для микрофлюидного устройства Ekinci необходимы образцы мочи, и оно не определяет инфекции, вызванными более чем одним видом бактерий. Другие, для которых требуются современные микроскопы или спектрометр, такие как кантилеверы, должны быть адаптированы, прежде чем их смогут использовать неспециалисты, работающие в клиниках с ограниченными ресурсами по всему миру.

По материалам www.nature.com