• Кабинет
  • Глава  3. Методы количественной оценки содержания липидов и липопротеидов в крови

    Международные названия

    Содержание

    Стандартизация измерения липидов, включая общий ХС, ХС ЛПВП и ТГ, а также липопротеинов была инициирована в начале 1970-х годов. К этому времени существовали пять основных методов измерения липидов, апо-А-I- и апо-B-липопротеинов. Чаще всего использовались лабораторные методы, базирующиеся на принципах радио- или электроиммунной диффузии, требующей инкорпорирования антител в гелевый матрикс. Технические характеристики указанных выше лабораторных методов измерения липидов полностью исключали возможность проведения автоматического анализа. Только с появлением в 1980- е годы иммунонефелометрического и иммунотурбидиметрического методов анализа появилась реальная возможность внедрения в рутинную лабораторную практику автоматических коммерческих тест-систем, основанных на использовании специфических антител в жидкой фазе. Это стало настоящей революцией в диагностике нарушений липидного обмена, что позволило проводить широкомасштабные эпидемиологические и клинические исследования, сопряженные с лабораторным анализом высокой точности.

    Основные методы подготовки образцов крови

    Большинство лабораторий предпочитают производить определение липидов в плазме крови после предварительной стабилизации путем дополнительного добавления 1 мг/мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), хотя сыворотка крови также может быть использована в качестве объекта для исследования. Тем не менее, именно плазма рассматривается многими экспертами как наиболее оптимальный субстрат, поскольку позволяет существенно удлинить период стабильности липидов в образце. Это позитивно сказывается на возможностях их транспортировки в лабораторию и, если необходимо, проводить исследования в течение первых 96 ч после получения образца и его центрифугирования. В последнем случае образец необходимо хранить при температуре не выше 4 °С. В качестве альтернативного метода хранения рассматривается немедленная заморозка образца плазмы/сыворотки крови при температуре –20 °С или, что более предпочтительно, –70 °С. В этих условиях стабильность образца сохраняется на протяжении 3 и 6 мес соответственно.

    Следует отметить, что концентрация липидов в сыворотке крови приблизительно на 3% выше, чем в плазме. В любой ситуации образец, взятый у здорового пациента натощак, должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим. В этом случае концентрация ТГ обычно нормальная (<2,25 ммоль/л). Мутность сыворотки или плазмы крови иногда со специфическим слегка оранжевым окрашиванием чаще всего свидетельствует о том, что кровь была взята не натощак, или у пациента отмечают гиперхиломикронемию, или повышение ЛПНП, или смешанную гиперлипидемию. Тем не менее, прозрачный образец не является гарантией нормального содержания в нем липидов.

    Оценка содержания общего ХС и липопротеидов

    Содержание общего ХС, а также основных фракций липопротеидов в плазме или сыворотке крови обычно определяется с помощью методов химического или ферментативного (энзиматического) анализа (табл. 3.1). Строго говоря, последний включает химические подходы к анализу содержания вещества в образце. Так, по мнению экспертов CDC (Center for Disease Control, США), метод оценки содержания общего ХС Абеля — Кендалла, базирующийся на спектрофотометрическом измерении конечных продуктов реакции Либермана — Бурхарда (гидролиза эстерифицированного ХС), является своеобразным золотым стандартом. Кроме того, унифицированными методами определения ХС также являются методы, основанные на реакции с уксусным альдегидом (метод Ильки), реакции с хлорным железом (метод Златкиса — Зака), реакции с хлорным железом после экстрагирования изопропанолом.

    Таблица 3.1  Методы оценки липидов в плазме (сыворотке) крови

    Липиды Методы лабораторного анализа
    Основные Альтернативные
    Общий ХС Энзиматический Химический
    ТГ Энзиматический
    ЛПНП, ЛПВП, ЛПОНП Ультрацентрифугирование ИФА, электрофорез в геле
    ХС ЛПВП Энзиматический (после осаждения других фракций)
    ХС ЛПОНП Непрямой расчетный метод по формуле: ТГ·0,46 (только в случае, если ТГ не выше 4,5 ммоль/л)
    ХС ЛПНП Непрямой расчетный метод по формуле Фридвальда (см. ниже) Прямой энзиматический, ИФА
    Апопротеины Иммунотурбидиметрический РИА

    ИФА — иммуноферментный метод, РИА — радиоиммунный метод.

    В основе ферментативного метода лежит способность холестериноксидазы деградировать ХС, в результате чего образуются холестенон и перекись водорода. Последние, в свою очередь, могут быть определены сравнительно простыми методами: холестенон — спектрофотометрически по изменению светопоглощения при длине волны 240 нм, а перекись водорода — методами, которые используются при определении глюкозы. Сложность ферментативного метода определения ХС обусловливается дефицитом соответствующих ферментов, которые трудно очистить от каталазы, разрушающей перекись водорода, а также тем, что фермент активен лишь в отношении свободного ХС, поэтому эфиросвязанный ХС должен быть предварительно гидролизирован. Кроме того, к одним из наиболее важных факторов, оказывающих негативное влияние на точность измерения содержания общего ХС, является высокий уровень ТГ. Некоторые образцы крови могут содержать частицы, обогащенные ТГ, величина которых достаточна для способствования рассеиванию света. При использовании монохроматических спектрофотометров этот феномен часто рассматривается как поглощение.

    Современные бихроматические приборы при использовании метода двухволнового измерения способны проводить коррекцию рассеивания света, вызванного повышением уровня ТГ, зачастую в автоматическом режиме. Кроме того, мутности образца, повышающего поглощение света, может способствовать гидролиз ТГ в липопротеидах. В принципе, все соединения со спектром поглощения в пределах 500 нм (гемоглобин, билирубин) могут повышать уровень поглощения и, тем самым, завышать результаты измерения. С другой стороны, при гемолизе содержание общего ХС может занижаться. Необходимо отметить, что метод двухволновой спектрофотометрии дает наименьшую погрешность измерения.

    В настоящее время ферментативые (энзиматические) методы широко применяют в различных автоматических системах измерения содержания общего ХС и хорошо сопоставляются с данными, полученными с помощью классического теста Абеля — Кендалла. Тем не менее, реальные значения величины общего ХС, полученные с помощью автоматизированных систем, могут быть на 2,6–4,9% выше таковых, полученных в ходе проведения измерения по Абелю — Кендаллу. Тем не менее, автоматизированные станции последних поколений, даже несмотря на то, что в них чаще всего используют капиллярную, а не венозную кровь, при надлежащем подходе к калибровке практически не дают статистически значимого отклонения от ожидаемого результата.

    Концентрацию общих липидов в сыворотке крови определяют также методом Свана в модификации Баумана (окрашенные судаковым черным липиды количественно извлекаются из сыворотки крови и определяются фотометрически) и турбидиметрическим методом (метод Уэрги), в основу которого положено измерение оптической плотности жировой эмульсии, образуемой при взаимодействии серной кислоты с n-диоксановым экстрактом липидов сыворотки крови. Для разделения смеси липидов используют методы тонкослойной хроматографии.

    Оценка содержания ТГ

    Для измерения содержания ТГ также используют химические (экстракция и восстановление фосфолипидов на твердых сорбентах с последующей сапонификацией высвобождаемого глицерина в ТГ) и ферментативные методы анализа. Последние базируются на четырех последовательных реакциях: конвертации ТГ в глицерин и СЖК с помощью специфической липазы, конвертации глицерина и АТФ в глицерол-3-фосфат и аденозиндифосфат (АДФ) с помощью глицеролкиназы, оксидативной конверсии глицерол-3-фосфата. Унифицированными методами определения содержания ТГ являются ферментативный метод, а также химические методы определения глицерина, который окисляют йодной кислотой до формальдегида, дающего с хромотроповой кислотой темно-фиолетовое окрашивание, а с ацетил-ацетоном— желтое.

    Основные методы идентификации фракций липопротеидов

    Методы оценки содержания ХС ЛПВП

    Первоначально липопротеиды, обладающие электрофоретической подвижностью β и пре-β, осаждаются гепарином в присутствии солей марганца и удаляются центрифугированием, при этом хиломикроны всплывают, образуя пленку. В растворе остаются только α-липопротеиды, в которых содержание ХС определяют любым из описанных методов, например, ферментативным с последующей спектрофотометрией или экстракционным методом с помощью реакции с хлорным железом после экстракции изопропанолом.

    Вместе с тем, в настоящее время преимуществом пользуются прямые методы измерения содержания ЛПВП. К их реальным преимуществам можно отнести, прежде всего, небольшой объем проб, необходимый для проведения анализа, незначительную интерференцию с билирубином, аскорбиновой кислотой и гемоглобином, а также с ТГ (<12 ммоль/л в образце), возможность использования автоматического анализатора, широкий диапазон измерений. Чаще всего используют метод иммуносепарации, в основе которого лежит образование иммунных комплексов со всеми липопротеидами за исключением ЛПВП. Для идентификации и измерения последних используют высокоточный ферментный метод (Durrington P.N., 1989).

    Методы оценки содержания ХС ЛПНП

    Обычно расчет плазменного содержания ЛПНП производится непрямым расчетным методом по формуле Фридвальда (Friedewald W.T. et al., 1972):

    ХС ЛПНП (мг/дл)=общий ХС–общий ХС ЛПВП–ТГ/5

    ХС ЛПНП (ммоль/л)=общий ХС–ХС ЛПВП–ТГ/2,2

    Эти формулы справедливы при всех уровнях плазменного содержания ТГ <500 мг/дл (5,5 ммоль/л) (Friedewald W.T. et al., 1972).

    Исходя из того, что ЛПНП — это количество ХС за вычетом ХС, содержащегося в ЛПОНП и в ЛПВП, количество ХС в ЛПОНП равно ТГ/5, так как концентрация ХС в ЛПОНП составляет примерно 1/5 общего количества липидов. Эта формула применяется в случаях, когда у пациента, обследуемого натощак, содержание ТГ <400 мг/дл. В полученные параметры ЛПНП входит ХС, содержащийся в ЛППП, и липопротеид (а) (ЛП (a)) (Durrington P.N., 1989).

    Кроме того, в специализированных лабораториях уровень ХС ЛПНП может быть измерен непосредственно с помощью ультрацентрифугирования, электрофореза или селективным ферментным методом (Boerma G.J.M. et al., 1986). Несмотря на то что прямые методы измерения ЛПНП дают более высокую погрешность измерения и до сих пор не все из них стандартизированы, они пригодны для использования в автоматических анализаторах, в качестве субстрата может выступать как сыворотка, так и плазма крови, объем самого образца существенно минимизирован, а выраженность интерференции с аскорбиновой кислотой, билирубином или гемоглобином, влияющая на точность измерения, крайне низка (Watson A.D., 2006).

    В настоящее время во многих лабораториях используют прямой селективный ферментный метод измерения содержания ХС ЛПНП в образце. В первой фазе реакции специальный «протективный» реактив селективно защищает ХС ЛПНП, при этом ХС, находящийся в других фракциях, остается свободным. После того как весь ХС за исключением ХС ЛПНП подвергается гидролизу и окислению в ферментативной реакции, происходит разрушение «протективного» реактива, а ХС ЛПНП измеряют ферментативным методом.

    Коэффициент атерогенности

    Для ориентировочной количественной оценки степени риска атеросклероза А.Н. Климовым и соавторами в 1977 г. был предложен так называемый холестериновый коэффициент атерогенности (КХС), представляющий собой отношение ХС атерогенных и ХС антиатерогенных липопротеидов:

    КХС = (ХСЛПНП + ХСЛПОНП)/ ХСЛПВП.

    Поскольку суммарное количество ХС атерогенных липопротеидов (ЛПНП и ЛПОНП) можно представить как разницу между общим ХС (ХСобщий) и ХСЛПВП, коэффициент атерогенности можно рассчитывать на основании определения только двух показателей — общего ХС и ХС ЛПВП:

    КХС = (ХСобщ — ХСЛПВП)/ ХСЛПВП.

    В норме у мужчин в возрасте 40–60 лет без клинических и других проявлений атеросклероза КХС не превышает 3,0–3,5. Вероятность развития атеросклероза относительно невелика при КХС <3,0. Коэффициент атерогенности в пределах 3,0–4,0 ассоциируется с умеренным, а >4,0 — с высоким риском развития атеросклероза.

    Ультрацентрифугирование

    Метод ультрацентрифугирования заключается в разделении липопротеидов на фракции при центрифугировании в течение 24–48 ч после предварительного окрашивания последних суданом черным. Скорость вращения ротора центрифуги должна составлять не менее 40 тыс. оборотов в минуту (Попов А.В. и соавт., 1975). К недостаткам данного способа относятся необходимость использования значительного числа реактивов, дополнительного оборудования, а также длительность анализа. Кроме того, этот способ также не является количественным, плохо воспроизводим, а разделение на фракции происходит по сложно определяемому параметру — плавучей плотности. Следует отметить, что для более качественного разделения на фракции липопротеидов в данном способе перед началом анализа в буфер образца добавляют соли типа NaBr для обеспечения в образцах заданной плотности, что также приводит к использованию дополнительных реактивов в значительном количестве, а объем образца может составлять 10–20 мл. После процесса разделения липопротеидов на фракции в ультрацентрифуге по данному способу проводится сканирование разделенных фракций оптическим методом с помощью специального приспособления, что приводит к усложнению способа: использованию дополнительного оборудования и увеличению продолжительности анализа. Общее время анализа липопротеидов по данному способу может составлять более 40 ч.

    Метод спектроскопии оптического смешения

    Метод спектроскопии оптического смешения заключается в предварительном отделении липопротеидов крови от других белков плазмы с помощью высокоскоростного ультрацентрифугирования в течение 24–48 ч, просвечивании образца липопротеидов в кювете лазерным излучением и измерении спектра рассеянного излучения вблизи длины волны лазерного излучения, математической обработке полученного при измерении физического сигнала (спектра) — I (λ) с помощью ЭВМ, определении фракционного состава липопротеидов по размерам (радиусам) — N(R) (Климов А.Н. и др., 1982). Недостатком данного способа является необходимость предварительного отделения липопротеидов плазмы от других белков крови, для чего используется дорогостоящее оборудование и в связи с этим увеличивается общая длительность анализа до 25–50 ч. Возможны изменения фракционного состава липопротеидов при их выделении в процессе ультрацентрифугирования. Данный способ также не позволяет получить количественные данные по фракционному составу липопротеидов. Кроме того, метод спектроскопии оптического смешения имеет низкое разрешение по размерам частиц липопротеидов, так как используется оптический диапазон длины волн (λ=4000–8000 А), а размеры липопротеидов: 50–600 А. Все это приводит к низкой точности определения фракционного состава липопротеидов крови, особенно в отношении ЛПВП. Следует отметить также пониженную информативность метода спектроскопии оптического смешения вследствие косвенных оценок размера липопротеидов через так называемый гидродинамический радиус частиц (R), который определяется из коэффициента диффузии и стоксовского приближения.

    Преципитация

    Традиционно методом преципитации на протяжении многих лет проводили измерение содержания ЛПВП. Метод базируется на осаждении всех частиц, за исключением ЛПВП, после центрифугирования и отделения осадка. В надосадочной жидкости производили измерение ЛПВП. Основной недостаток метода — высокая доля ручной работы, что ограничивало применение автоматизированных систем анализа, негативно отражалось на стоимости исследования и способствовало повышению вариабельности полученных данных. Кроме того, необходимо отметить, что определение методом преципитации ЛПВП ограничено довольно значительным влиянием интерференций, вызванных главным образом ТГ, которые в высоких концентрациях препятствуют осаждению преципитата. Все это существенным образом повышает риск возникновения ошибок измерения, в связи с чем в настоящее время в большинстве сертифицированных лабораторий используют прямые методы определения ЛПВП (см. выше).

    Определение фракций липопротеидов методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле

    Предварительно липопротеиды окрашивают. Для этого к 0,3 мл исследуемой сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и 0,05 мл трис-буфера pH 6,7, после чего смесь перемешивают и оставляют на 1 ч в темноте. После этого 0,03–0,05 мл препарата наносят на поверхность уже сформированного геля и подвергают электрофорезу в направлении сверху вниз в колонке, заполненной четырьмя слоями полиакриламидного геля. Нижний слой геля самый мелкопористый, верхний — самый крупнопористый. Липопротеиды в зависимости от размера их молекул задерживаются в разных участках геля. Электрофорез проводят в течение 1–4 ч при силе тока 4–5 мА на трубку. После окончания электрофореза гель фиксируется, сушится и сканируется с помощью специального устройства (сканера). Для получения количественных результатов при электрофоретическом разделении липопротеидов в геле акриламида используют варианты денситометрии и элюции. Однако на практике при фенотипировании гиперлипидемий используют визуальные оценки электрофореграмм: констатируют увеличение или уменьшение количества хиломикрон, ЛПНП (β-фракции) или ЛПОНП (пре-β-фракции) и ЛПВП (α-липопротеиды) при сравнении с нормой (референсным уровнем). К недостаткам данного способа относится использование значительного числа реактивов, дополнительного оборудования и сложных методик приготовления красителей, геля, а также необходимость сканирования специальной техникой. Кроме того, этот метод не является количественным, трудно воспроизводим, а распределение (разделение) липопротеидов на фракции происходит по сложно определяемому параметру — электрофоретической подвижности. Общее время анализа может составлять 7–12 ч. Однако именно этот метод принят ВОЗ как основной из-за его относительной экспрессности и широкой распространенности необходимого оборудования. Метод в основном используется для диагностирования дислипопротеидемий.

    Препаративное ультрацентрифугирование

    Препаративное ультрацентрифугирование представляет собой метод анализа структуры отдельных фракций липопротеидов, заключающийся в предварительной подготовке образцов для анализа путем отделения исследуемых фракций липопротеидов от других белков плазмы крови. В образец и буфер вводят рентгеноконтрастное вещество с последующим их просвечиванием коллимированным рентгеновским пучком и измерением малоугловых рентгенограмм рассеивания от образца и буферной смеси. После математической обработки полученных данных вычисляют структурные параметры липопротеидов. С помощью данного способа оценивается степень гомогенности и полидисперсности выделенных фракций липопротеидов плазмы крови (Laggner P., Muller K.W., 1978). Недостатком данного способа является анализ структуры только отдельных фракций и субфракций липопротеидов. Для этого исследуемые фракции липопротеидов отделяют от других белков плазмы крови, используя дополнительное оборудование (ультрацентрифуга), в течение 24–48 ч. В данном способе для анализа липопротеидов не может быть использована цельная плазма крови из-за невозможности учета вклада в рентгенограмму рассеивания от других белков крови (альбумин, α-, β-, γ-глобулины и др.). Общее время анализа данным способом может составлять 26–51 ч и более.

    Анализ липопротеидов в плазме крови методом малоуглового рентгеновского рассеивания

    Этот метод включает приготовление основного образца, представляющего собой цельную плазму или сыворотку крови с добавлением в него рентгеноконтрастного вещества, и дополнительного образца для учета фонового рассеивания рентгеновского излучения, представляющего собой водный растворитель белков плазмы крови с добавлением того же рентгеноконтрастного вещества, которое вводят в сухом виде в количестве, достаточном для получения в образцах плотности водного растворителя, равной плотности белковых оболочек липопротеидов и свободных белков плазмы крови, а также облучение обоих образцов коллимированным рентгеновским излучением и измерение интенсивности рассеяния рентгеновского излучения в диапазоне малых углов с последующей математической обработкой. Недостатком указанного способа является то, что он позволяет определять значения отдельных фракций липопротеидов и их суммарные значения только в относительных единицах, но не дает возможности определять абсолютные значения концентраций отдельных фракций липопротеидов, что снижает точность измерения.

    В настоящее время предложены более современные методы идентификации фракций липопротеидов, такие как капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография, зональное ультрацентрифугирование в вертикальном роторе и метод ядерно-магнитно резонансной (ЯМР)-спектроскопии, которые дают идентичные результаты. Во фракции ЛПНП выявляют четыре субфракции — большие, средние, малые и очень малые ЛПНП. При этом процентное соотношение четырех субфракций ЛПНП, которое получают при применении каждого из методов, разное; в силу этого положительная корреляция между относительными величинами отдельных субфракций ЛПНП находится на грани достоверности.

    Наиболее достоверными данными соотношения субфракций ЛПНП считаются полученные методом ЯМР-спектроскопии при определении гетерогенности неполярных липидов. Именно липиды, которые связаны с молекулой апо-В100 в каждой из субфракций ЛПНП, и определяют конформацию, пространственную, стерическую форму молекулы и фомирование апо-В100-лиганда. Метод ЯМР-спектроскопии позволяет верифицировать гетерогенность неполярных липидов. Полагают, что апо-В100-липопротеины в каждой из субфракций ЛПНП в значительной степени определяют конформацию, пространственную, стерическую форму молекулы и формирование апо-В100-лиганда.

    Разрешающая способность капиллярного электрофореза намного выше по сравнению с зональным электрофорезом в геле агарозы. Используя его, удается разделить 4 субфракции ЛПВП, одну фракцию ЛОНП и 4 субфракции ЛПНП, включая ЛППП; четвертая субфракция ЛПНП на электрофорезе бывает не всегда. Метод дает возможность проследить за динамикой содержания субфракций ЛПВП в процессе гиполипидемической терапии семейной патологии или лечении вторичных форм гиперлипидемии при заболеваниях печени и почек. Следует отметить, что при идентификации фенотипа семейных форм гиперлипидемии по Фредриксону, фракцию α-липопротеидов (ЛПВП) не используют. Вместе с тем, определение субфракций ЛПВП позволяет дифференцировать редкие формы врожденной патологии, такие как семейная недостаточность ЛХAT, которая у человека нарушает поглощение клетками СЖК, приводя к атеросклерозу, и семейная гиперальфалипопротеидемия, для которой характерна определенная резистентность к манифестации атеросклероза. Необходимо отметить, что методы капиллярного электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонках с гелем и метод ЯМР-спектроскопии можно использовать для целей фенотипирования семейных форм гиперлипидемии. Однако внедрение последних в широкую клиническую практику пока ограничено их высокой стоимостью и трудоемкостью.

    Идентификация апо-А, апо-В и ЛП (a)

    Поскольку апо-А- и апо-В-липопротеины представлены в липопротеидах различных типов, а в частице ЛП (a) присутствуют обе молекулы аполипопротеина, то основной проблемой, с которой сталкиваются при измерении содержания апо-А и апо-В, является высокая вариабельность полученных результатов. Попытка детектировать эпитопы апо-В в образце после его обработки антисывороткой с помощью моноклональных антител показали, что полученные данные могут существенным образом варьировать. Последнее обстоятельство связывали с продолжающимся липолизом в сыворотке крови, что приводило к изменению соотношения ЛПОНП и ЛПНП — основного циркулирующего пула апо-В-липопротеинов. Напротив, при измерении апо-А1 возникает меньше сложностей как с обработкой данных, так и с их интерпретацией. Однако необходимо отметить, что относительно низкая вариабельность измеряемых значений апо-А1 в образцах крови была достигнута после использования метода частичной делипидации ЛПВП с помощью тетраметилмочевины. Следует помнить и о том, что при использовании антисыворотки к апо-В-липопротеинам в результате последующих измерений концентрации последнего в образце с помощью моноклональных антител будут детектированы апо-В-липопротеины, содержащиеся как в ЛПНП, ЛППП, ЛПОНП, так и в ЛП (a). К настоящему времени методы измерения аполипопротеинов стандартизированы в соответствии с требованиями World Health Organization/International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine International Reference Materials for apo AI and apo B measurement (см. ниже).

    Радиоиммунный метод

    Этот метод измерения аполипопротеинов имел определенные преимущества, в основном связанные с его высокой чувствительностью, особенно при измерении малых концентраций субстрата, и минимизацией объема используемой поливалентной антисыворотки или моноклональных антител. В то же время он не был лишен ряда серьезных недостатков, таких как необходимость применения радиоизотопа (I125), требующего особых методов хранения и утилизации, относительно большого объема образца, необходимого для проведения измерения, а также наличия дорогостоящего оборудования.

    Метод радиальной иммунной диффузии

    Основными преимуществами этого метода измерения аполипопротеинов являются относительная простота, дешевизна, высокая точность, малый объем разбавления образца и отсутствие необходимости в использовании дорогостоящего оборудования. В то же время все эти позитивные качества реализуются только при применении специфических антител, вызывающих отчетливую преципитацию. Последнее обычно достижимо только при использовании достаточно большого объема поливалентной антисыворотки. Кроме того, при применении этой методики требуется наличие серьезного опыта у персонала, иногда она сопряжена с необходимостью большого объема ручного труда, в основном ассоциированного со стандартизацией самой манипуляции. От последней, в частности, зависит и интерпретация полученных данных. Тем не менее, в отличие от радиоиммунного метода, этот метод дает возможность детектировать раздельное содержание апо-В100-липопротеина в ЛПНП, ЛПОНП и ЛП (a).

    Иммунонефелометрический метод

    Появление иммунонефелометрического метода позволило существенным образом упростить и удешевить измерение аполипопротеинов, а также способствовать развитию методов автоматизированного анализа. Кроме того, к положительным сторонам этого метода относят низкий объем требуемого для анализа образца и хорошую точность полученных данных. В то же время, основным лимитирующим фактором, ограничивающим точность метода, является высокая способность сыворотки с повышенным содержанием липопротеинов к рассеиванию света, что приводит к некоторому завышению результатов измерения. Тем не менее, иммунонефелометрический метод широко распространен и очень популярен в основном благодаря низкой трудоемкости, простоте выполнения в автоматическом режиме и скорости получения данных.

    Метод электроиммунофореза

    Этот метод обладает умеренной точностью, неплохой воспроизводимостью. Нет необходимости в использовании достаточно большого объема образца и преципитирующей поливалентной антисыворотки. Для проведения измерения образец можно развести в 10–40 раз. В то же время, этот метод требует длительного периода времени для получения качественного результата. Кроме того, необходимо помнить и о том, что электроиммунофорез липопротеинов показан только в том случае, когда плазменное содержание ТГ превышает 4 ммоль/л. Существуют и некоторые технические ограничения при использовании этого подхода. Так, липопротеины апо-А1 и апо-В могут измеряться вместо ЛПВП и ЛПНП соответственно с целью более точной идентификации последних, особенно ЛПНП. Однако при семейной гипераполипопротеинемии В (уровень ЛПНП нормальный, уровень апо-В повышен) подобный подход не рекомендован (Marcovina S.M., Albers J.J., 1989).

    Иммуноферментные методы (ELISA — enzyme-like immunosorbent assay)

    Потенциальными преимуществами иммуноферментных методов являются небольшой объем образца крови (сыворотки) и реагентов, требующийся для проведения исследования, высокая скорость анализа, возможность проведения измерений в автоматическом режиме. Вместе с тем, при интерпретации полученных данных необходимо учитывать частоту возможных перекрестных реакций с потенциально нежелательными эпитопами.

    Оценка функциональной активности рецепторов к ЛПНП

    Традиционно оценка функциональной активности и экспрессии рецепторов ЛПНП производится путем измерения их способности к связыванию последних на поверхности мембран лимфоцитов (Cuthbert J.A. et al., 1986).

    Критерии качества проведенных измерений

    Стандартизация и основные методы оценки качества измерения ХС и фракций липопротеидов

    Точность и сопоставимость измерений общего ХС и фракций липопротеидов обычно не вызывают каких-либо нареканий. Тем не менее, в течение суток даже у здоровых людей отмечают колебания содержания общего ХС до 7,2–10%; ХС ЛПВП — в пределах 7,5%, а ТГ — около 25% (Nazir D.J. et al., 1999). Ошибки измерения указанных показателей при их ежедневном мониторировании (day-to-day measurement) в пределах обсуждаемых значений заложены в стандарты качества лабораторий во многих странах мира (Warnick G.R., 2000). Основные причины возникновения вариабельности полученных концентраций липидов в плазме (сыворотке) крови принято градуировать на три группы: индивидуальные вариации, лабораторные вариации и случайные погрешности измерения. Для минимизации вклада случайных вариаций в расширение дисперсии полученных данных все определения указанных показателей необходимо производить натощак (через 12 ч после последнего приема пищи) в стандартных условиях и, желательно, в одной и той же лаборатории, если требуется последующее мониторирование параметров (Gaziano T.A. et al., 2008). При соблюдении всех необходимых условий точность измерения плазменного (сывороточного) содержания общего ХС не должна превышать 0,28 ммоль/л (Westgard J.O., Darcy T., 2004).

    Кроме того, существуют и внелабораторные причины изменения плазменной концентрации липидов. Среди них наиболее важное значение имеют взятие образца крови не натощак, отказ от использования вакуумных пробирок (вакутейнеров), длительное наложение жгута (более чем на 2 мин), хранение образца более 48 ч в охлажденном виде или более 3 мес при температуре –30 °С после немедленной заморозки, отказ от заморозки образца крови непосредственно после центрифугирования.

    На содержание липидов в образце могут оказать влияние факторы, роль которых при проведении диагностических исследований иногда необходимо минимизировать. Последние приведены в табл. 3.2.

    Таблица 3.2 Основные факторы, способствующие изменению плазменного (сывороточного) содержания липидов

    Факторы Компоненты липидного профиля
    Общий ХС ЛПНП ЛПОНП ЛПВП ТГ Апо-А-I Апо-В ЛП (a)
    Курение
    Физическая нагрузка
    Употребление алкоголя (до 2 унций [36 г/сут])
    Употребление алкоголя (до 6 унций [100 г/сут])
    Психоэмоциональный стресс
    Высококалорийная диета
    Вегетарианская диета

    Для пациентов с инфарктом миокарда оценка уровня липидов в крови должна производиться не ранее чем через 8 ч после возникновения последнего (Hainline A. et al., 1982).

    Стандартизация и основные методы анализа аполипопротеинов

    Стандартизация измерений апо-А и апо-В-липопротеинов была инициирована Centers for Disease Control (CDC) в сотрудничестве с International Union of Immunological Societies в 1991 г. после того как было доказано клиническое значение измерений плазменной концентрации этих липопротеинов (Marcovina S.M., Albers J.J., 1989). В последующем оказалось, что оценка содержания апо-А, апо-В, их соотношения, а также отношения общий ХС/апо-А являются иногда даже более валидными показателями, чем ХС ЛПНП или общий ХС плазмы крови (Lamarche B. et al., 1996; Gotto A.M. Jr. et al., 2000; Walldius G. et al., 2001; Ingelsson E. et al., 2007; Andrikoula M., McDowell I.F.W., 2008; Lind L., 2008; McQueen M.J. et al., 2008). Все это потребовало унификации методов измерения апопротеинов.

    Независимая оценка точности проводимых измерений в различных лабораториях продемонстрировала существование вариабельности этого показателя для апо-А и апо-В-липопротеинов в пределах 15 и 24% соответственно (Cooper G.R. et al., 1991). В качестве основных причин выявленных различий рассматривались, прежде всего, различные методы калибровки лабораторного оборудования, низкая воспроизводимость тестов, недостаточная точность разведения образцов (Cooper G.R. et al., 1991). С целью унификации методов проведения исследования и минимизации вариабельности измеряемых концентраций аполипопротеинов в образцах, были предложены стандартизированные аналитические промышленные системы, основанные на иммунохимических методах измерения, а требования к их лабораторному применению — унифицированы (Marcovina S.M. et al., 1991; Albers J.J. et al., 1992). В результате вариабельность точности измерений апо-А и апо-В-липопротеинов не превышает 2,1–5,6% и 3,1–6,7% соответственно при условии проведения адекватной калибровки (Marcovina S.M. et al., 1993; Marcovina S.M. et al., 1994). В настоящее время разработаны, стандартизированы и производятся материалы для калибровки референсных образцов в соответствии с требованиями World Health Organization/International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine International Reference Materials for apo A-I and apo B measurement. Именно последние были применены при проведении таких крупных исследований, как NHANES III и Framingham Offspring studies (Contois J.H. et al., 1996a; b; Bachorik P.S. et al., 1997). Широкое использование высококачественных референсных образцов позволило снизить вариабельность полученных данных в ряде рандомизированных клинических исследований, проведенных в странах Европы, несмотря на то, что с методологической точки зрения большинство использованных промышленных автоматизированных систем для анализа уровня апопротеинов в этих странах различается (Leino A. et al., 1995; Graziani M.S. et al., 1998; Jungner I. et al., 1998).

    Литература

    1. Попов А.В., Андреева Л.И., Кузнецов А.С. (1975) Вопросы мед. химии, 21(4): 434–437.
    2. Климов А.Н., Шмелев Г.Е. и др. (1982) Биофизика, 27(3): 458–462.
    3. Albers J.J., Marcovina S.M., Kennedy H. (1992) International Federation of Clinical Chemistry standardization project for measurements of apolipoproteins A-I and B. II. Evaluation and selection of candidate reference materials. Clin. Chem., 38: 658–662.
    4. Andrikoula M., McDowell I.F.W. (2008) The contribution of ApoB and ApoA1 measurements to cardiovascular risk assessment. Diabetes Obes. Metab., 10: 271–278.
    5. Bachorik P.S., Lovejoy K.L., Carroll M.D. et al. (1997) Apolipoprotein B and AI distributions in the United States, 1988–1991: results of the National Health and Nutrition Examination Survey III (NHANES III). Clin. Chem., 43: 2364–2378.
    6. Boerma G.J.M., Jansen A.P., Jansen R.T.P. et al. (1986) Minimizing interlaboratory variation in routine assays of serum cholesterol through the use of serum calibrators. Clin. Chem., 32: 943–947.
    7. Contois J.H., McNamara J.R., Lammi-Keefe C.J. et al. (1996) Reference intervals for plasma apolipoprotein A-I determined with a standardized commercial immunoturbidimetric assay: results from the Framingham Offspring Study. Clin. Chem., 42: 507–514a.
    8. Contois J.H., McNamara J.R., Lammi-Keefe C.J. et al. (1996) Reference intervals for plasma apolipoprotein B determined with a standardized commercial immunoturbidimetric assay: results from the Framingham Offspring Study. Clin. Chem., 42: 515–523b.
    9. Cooper G.R., Henderson L.M., Smith S.J. et al. (1991) Clinical applications and standardization of apolipoprotein measurements in the diagnostic workup of lipid disorders. Clin. Chem., 37: 619–620.
    10. Cuthbert J.A., East, C.A., Bilheimer D.W. (1986) Detection of familial hypercholesterolemia by assaying functional low-density-lipoprotein receptors on lymphocytes. N. Engl. J. Med., 314: 879–883.
    11. Durrington P.N. (1989) Normal serum lipid and lipoprotein concentrations. Hyperlipidaemia Diagnosis and management. London: PG Wright: 56–86.
    12. Friedewald W.T., Levy, R.I., Fredrickson D.S. (1972) Estimation of the concentration of low density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin. Chem., 18: 499–502.
    13. Gaziano T.A., Young C.R., Fitzmaurice G. et al. (2008) Laboratory-based versus nonlaboratory-based method for assessment of cardiovascular disease risk: the NHANES 1 Follow-up Study cohort. Lancet, 371: 923–931.
    14. Gotto A.M. Jr., Whitney E., Stein E.A. et al. (2000) Relation between baseline and ontreatment lipid parameters and first acute major coronary events in the Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study (AFCAPS/Tex-CAPS). Circulation, 101: 477–484.
    15. Graziani M.S., Zanolla L., Righetti G. et al. (1998) Plasma apolipoproteins A-I and B in survivors of myocardial infarction and in a control group. Clin. Chem., 44: 134–140.
    16. Hainline A., Karon J., Lippel K. (eds) (1982) Manual of Laboratory Operations. Lipid Research Clinics Program, Lipid and Lipoprotein Analysis, 2nd edn. Bethesda, MD: NIH — Department of Health and Human Services.
    17. Ingelsson E., Schaefer E.J., Contois J.H. et al. (2007) Clinical utility of different lipid measures for prediction of coronary heart disease in men and women. JAMA, 298: 776–785.
    18. Jungner I., Marcovina S.M., Walldius G. (1998). Apolipoprotein B and A-I values in 147,576 Swedish males and females, standardized according to the World Health Organization-International Federation of Clinical Chemistry First International Reference Materials. Clin. Chem., 44: 1641–1649.
    19. Laggner P., Muller K.W. (1978) Quart. Rev. of Biophysics, 11(3): 371–425.
    20. Lamarche B., Moorjani S., Lupien P.J. et al. (1996) Apolipoprotein A-I and B levels and the risk of ischemic heart disease during a five-year follow-up of men in the Quebec cardiovascular study. Circulation, 94: 273–278.
    21. Leino A., Impivaara O., Kaitsaari M. et al. (1995) Serum concentrations of apolipoprotein A-I, apolipoprotein B, and lipoprotein(a) in a population sample. Clin. Chem., 41: 1633–1636.
    22. Lind L. (2008) Apoprotein B/A1 and risk of cardiovascular disease. Lancet, 372: 185–186.
    23. Marcovina S.M., Albers J.J. (1989) Standardization of the immunochemical determination of apolipoproteins A-I and B: a report on the International Federation of Clinical Chemistry meeting on standardisation of apolipoprotein A-I and B measurements (basis for future consensus), Vienna, Austria, April 18–19, 1989. Clin. Chem., 35: 2009–2015.
    24. Marcovina S.M., Albers J.J., Dati F. et al. (1991) International Federation of Clinical Chemistry standardization project for measurements of apolipoproteins A-I and B. Clin. Chem., 37: 1676–1682.
    25. Marcovina S.M., Albers J.J., Henderson L.O. et al. (1993) International Federation of Clinical Chemistry standardization project for measurements of apolipoproteins A-I and B. III. Comparability of apolipoprotein A-I values by use of international reference material. Clin. Chem., 39: 773–781.
    26. Marcovina S.M., Albers J.J., Kennedy H. et al. (1994) International Federation of Clinical Chemistry standardization project for measurements of apolipoproteins A-I and B. IV. Comparability of apolipoprotein B values by use of international reference materials. Clin. Chem., 40: 586–592.
    27. McQueen M.J., Hawken S., Wang X. et al. (2008) Lipids, lipoproteins, and apolipoproteins as risk markers of myocardial infarction in 52 countries (the INTERHEART study): a case-control study. Lancet, 372: 224–233.
    28. Nazir D.J., Roberts R.S., Hill S.A. et al. (1999) Monthly intra-individual variation in lipids over a 1-year period in 22 normal subjects. Clin. Biochem., 32(5): 381–389.
    29. Walldius G., Jungner I., Holme I. et al. (2001) High apolipoprotein B, low apolipoprotein A-I, and improvement in the prediction of fatal myocardial infarction (AMORIS study): a prospective study. Lancet, 358: 2026–2033.
    30. Warnick G.R. (2000) Measurement of cholesterol and other lipoprotein constituents in the clinical laboratory. Clin Chem Lab Med., 38(4): 287–300.
    31. Watson A.D. (2006) Thematic review series: Systems Biology Approaches to Metabolic and Cardiovascular Disorders. Lipidomics: a global approach to lipid analysis in biological systems. J. Lipid Res., 47: 2101–2111.
    32. Westgard J.O., Darcy T. (2004) The truth about quality: medical usefulness and analytical reliability of laboratory tests. Clin. Chim. Acta., 346(1): 3–11.
    Дата добавления: 21.10.2019 г.
    На нашем сайте используются файлы cookies для большего удобства использования и улучшения работы сайта. Продолжая, вы соглашаетесь с использованием cookies.
    Developed by Maxim Levchenko