Изучение количества митозов в опухоли

Количество опухолевых клеток, синтезирующих ДНК (фракция S-фазы), коррелирует с темпом роста опухоли и клиническим прогнозом [20–24]. Фракция S-фазы может быть оценена несколькими путями [24]. Это рутинный подсчет на гистологических срезах клеток с измененными ядрами вследствие появления вновь синтезированных ДНК, проточная цитометрия и иммуногистохимческое определение клеток в состоянии митоза. Каждый из перечисленных методов дает важную информацию, но наиболее часто используют первый. Подсчет митотических фигур с помощью светового микроскопа остается дешевым и эффективным методом. Опухолевая клетка делится и, пройдя митотический цикл, образует две новые клетки. Этот процесс проявляется изменением структуры клеток и появлением фигур митоза. В S-фазе ядерная мембрана отсутствует, так как клетка прошла профазу, хромосомы конденсированы, присутствует нитевидный расширенный ядерный материал, который группируется по диаметру клетки (начало метафазы) или в виде отдельных глыб хромосомных агрегатов (телофаза). Во время митоза цитоплазма более выражена. Важно научиться отличать клеточные митозы от апоптоза. При апоптозе ядро расширено, однако нет нитевидных структур хроматина, в центре ядра оптически пустая зона, вокруг которой сгруппирован хромосомный материал в виде круга или апоптатических ядерных сегментов, цито­плазма эозинофильная. Если есть сомнения в том, что это митоз, лучше не учитывать клетку при подсчете индекса митотической активности.

Хорошо подготовленный патолог может определить при просмотре срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, фигуры митоза и вычислить индекс митотической активности. Многие исследователи считают, что индекс митотической активности является наиболее важным прогностическим показателем РМЖ [25]. I. Jannink и соавторы утверждают, что классическая техника опре­деления индекса митотической активности остается быстрым, простым и наиболее точным методом. Фигуры митоза подсчитывают в большом количестве клеток по периферии опухоли, в наиболее пролиферирующем участке, избегая зон воспаления, некрозов, кальфикации, карцином in situ и крупных сосудов. Индекс митотической активности определяют подсчетом митозов в десяти полях зрения, начиная с зон наивысшей их плотности при х 400 с диаметром поля зрения 0,45 или 0,16 мм² [26]. Однако возникают сложности при изучении опухоли с большим количеством стромы, выраженном полиморфизме опухолевых клеток с наличием крупных аномальных ядер и опухоли, содержащей значительное количество клеток в состоянии апо­птоза. Очень сложно подсчитать фигуры митоза в опухоли с незначительной митотической активностью. Этот метод подвергался критике в связи с тем, что подобный подсчет субъек­тивный. Кроме того, запоздалая фиксация может привести к потере митотических фигур [21, 25, 26].

Однако Р.J. van Diest и соавторы показали, что жесткое соблюдение критериев подсчета индекса митотической активности приводит к высокой точности исследования.

На сегодня установлено, что иммуногистохимическое исследование экспрессии ядерного белка Ki-67 (клон MIB-1) достоверно определяет клетки, находящиеся в состоянии митоза, поэтому этот метод все чаще применяют в научной и медицинской практике для оценки пролиферативной активности опухолей различной локализации, в том числе и РМЖ [27]. Этот метод более легко воспроизводим, более точен, поэтому и приобрел популярность (фото 90). Но и у него есть недостатки, так как иммунореактивность Ki-67 во многом зависит от целого ряда методических параметров, таких как сроки фиксации образца ткани, условия его обработки и метод демаскировки антигена. Запоздалая фиксация уменьшает количество выявленных митозов в опухоли. Результаты исследования свидетельствуют, что задержка фиксации на 3 ч уменьшает количество митозов на 10–13%. Серьезной проблемой является значительная гетерогенность опухоли, которая проявляется в разном количестве митозов в различных участках опухоли. D. Verhoeven и соавторы сравнили количество митозов в разных участках опухоли и отметили, что на периферии инвазивного рака клетки имеют более высокую митотическую активность, чем в центре [29].

Однако преимуществом иммуногистохимичского метода является то, что антитела к белкам, участвующим в митотическом цикле, позволяют дифференцировать клетки в состоянии митоза и не окрашивают клетки в состоянии апоптоза.

Кроме антитела Ki-67 применяют, хотя еще не очень широко, другие маркеры клеточной пролиферации, такие как ДНК-топоизомераза IIa и различные циклины. Топоизомераза IIa — фермент, участвующий в процессе клеточного деления, функция которого заключается в сегрегации хромосом. Данную топоизомеразу выявляют в клетках, находящихся преимущественно в S-фазе клеточного цикла. Этот белок более устойчив к повреждающему воздействию различных фиксаторов и протео­литических ферментов [28].

Циклины — это семейство белков — регуляторов клеточного цикла, которые осуществляют контроль над его различными фазами. Циклины D1 и Е регулируют течение фазы G-1, а циклин В контролирует прохождение клеточного цикла от фазы G-2 к фазе М. Циклин А наиболее интенсивно экспрессируется в S-фазе, причем его экспрессия совпадает с пиком редупликации ДНК. В связи с этим циклин А рассматривают в качестве наи­более приемлемого маркера для изучения пролиферации клеток в опухоли, хотя точная структура этого протеина, так же как и кодирующего гена, пока до конца не установлена. Возрастание экспрессии циклина А четко коррелирует со злокачественной прогрессией опухолей [29].

Кроме перечисленных антигенов, следует упомянуть ядерный антиген пролиферирующих клеток. Изучению этого антигена посвящено большое количество работ и доказана его значимость в качестве показателя активности пролиферации клеток. R. Bravo и соавторы идентифицировали его в 1987 г. как добавочный белок дельта-ДНК-полимеразы, участвующий в синтезе ДНК. Из существующих 4 типов антител наиболее широко используют клон РС10. Экспрессия ядерного антигена пролиферирующих клеток коррелирует с другими маркерами пролиферации, такими как мечение 5-бром-2-дезоксиуридином, Ki 67 (MIB-1), величиной фракции S-фазы, определенной с помощью проточной цитометриии. Метод прост в исполнении и дает четкое окрашивание ядер. Однако результаты ряда исследований указывают на то, что использование ядерного антигена пролиферирующих клеток приводит к окрашиванию большего количества клеток, что не соответствует пролиферативным потенциям ткани [32]. Поэтому мы в своей практике для изучения индекса пролиферации используем иммуногистохимический метод с антителом Ki 67 (MIB-1) и считаем этот маркер наиболее оптимальным.